Hodowla i utrzymanie bakterii wykazujących ekspresję RNAi

Streszczenie

Źródło: Anderson, Q. L., et al., A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film pokazuje przygotowanie bakterii interferencyjnych RNA (RNAi) przenoszących plazmidy w celu zahamowania ekspresji genów docelowych. Przedstawiono w nim etapy selekcji, wzrostu i indukcji bakterii RNAi w celu wytworzenia płytek z ekspresją dsRNA do dalszych testów.

Protokół

1. Przygotowanie bakterii interferencyjnych RNA (RNAi)

1. Usunąć lub przenieść pożądane szczepy bakterii zawierających RNAi na płytki agarowe bulionu lizogennego (LB) zawierające odpowiednie antybiotyki (karbenicylinę w stężeniu 100 μg/ml i tetracyklinę w stężeniu 15 μg/ml dla bibliotek Ahringer i Vidal) z zamrożonego bulionu.
   Nuta: Podczas pracy z bakteriami niepatogennymi należy używać komory bezpieczeństwa biologicznego poziomu bezpieczeństwa (BSL)-2 A/B lub okapu z przepływem laminarnym BSL-1, aby zapewnić sterylność kultur i zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego biblioteki.
2. Inkubować płytki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.
3. Płytki należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni.
   1. Po dwóch tygodniach wyrzuć talerze i zastąp je świeżo przygotowanymi talerzami.
4. Przetestuj wiele szczepów RNAi równolegle, indywidualnie inokulując pojedynczą kolonię z każdego klonu do 4 ml LB uzupełnionego karbenicyliną w jednym dołku 24-dołkowej płytki głębinowej lub w sterylnej probówce.  
   Nuta: Doniesiono, że tetracyklina zmniejsza wydajność RNAi. Nie używaj go w tym medium.
5. Umieścić 24-dołkowe płytki głębinowe w inkubatorze z wytrząsaniem zoptymalizowanym dla płytek wielodołkowych i inkubować w temperaturze 37 °C przez 16 godzin, wytrząsając z prędkością 950 obr./min. Nuta: Trudno jest uzyskać równomierny wzrost bakterii na płytkach wielodołkowych przy użyciu konwencjonalnego inkubatora z wytrząsaniem. Inkubator z wytrząsaniem musi być w stanie wytrząsać z prędkością co najmniej 750 obr./min, aby kultury mogły prawidłowo rosnąć. W przypadku braku specjalistycznego shakera możliwe jest wyhodowanie każdej kultury w indywidualnej tubie. Kultury można przenieść na płytkę 24-dołkową w celu późniejszego odwirowania.
6. Zebrać bakterie, wirując przez 5 minut przy 2,000 x g.
7. Zdekantować supernatant poprzez odwrócenie płytki i energiczne potrząsanie. Zawiesić bakterie RNAi w 100 μl S Basal (5,85 g chlorku sodu, NaCl; 1 g fosforanu dipotasu,_K2HPO₄; 6 g fosforanu monopotasowego, KH₂PO₄ rozpuszczonego w 1 l ultraczystej wody i wysterylizowanego w autoklawie).
8. Odpipetować zawieszone bakterie do odpowiedniej liczby studzienek wielodołkowej płytki NGM (pożywka dla nicieni, 3 g NaCl, 2,5 g peptonu, 1 mM chlorek wapnia, CaCl₂; 1 mM siarczan magnezu,_MgSO4; 25 ml buforu fosforanowego (ilość na litr: 132 ml_K2HPO₄ (1 M) i 868 ml KH₂PO₄ (1M)) i 18 g agaru na litr wody) uzupełnione IPTG (izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozyd; stężenie końcowe 1 mM) i karbenicylina (100 μg/ml stężenie końcowe).
   1. Użyj 3.5 ml pożywki NGM na dołek płytki 6-dołkowej, 1 ml na dołek płytki 24-dołkowej lub 150 μl na dołek płytki 96-dołkowej.
   2. Użyj 100 μl/basenik bakterii na płytkę 6-dołkową, 50 μl/dołek na płytkę 24-dołkową lub 20 μl/basenik na płytkę 96-dołkową. Pozostawić do wyschnięcia.
      Nuta: Suszenie odbywa się zwykle w sterylnym okapie przepływowym, aby zapewnić szybkie, równomierne suszenie. Równomierne suszenie jest bardzo ważne. Unikaj nadmiernego suszenia, ponieważ pęknięcia w agarze sprzyjają zakopywaniu się robaków. Prowadzi to do strat ślimaków i potencjalnego zatkania systemów obsługi cieczy.
9. Przygotowane płytki należy zużyć natychmiast lub przechowywać je w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni w celu późniejszego wykorzystania.
   Nuta: Aby zapobiec wysychaniu talerzy, można je uszczelnić plastikową folią parafinową lub umieścić w szczelnie zamkniętym pojemniku z wilgotnymi ręcznikami papierowymi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
24 Blok RB studni głębinowej	Thermo Fisher Naukowy	CS15124
Pożywki hodowlane nicieni (NGM)			Ilość na litr: 18 gramów agaru, 3 gramy chlorku sodu, 2,5 grama peptonu, 1 ml chlorku wapnia (1 M), 1 ml siarczanu magnezu (1 M), 25 ml buforu fosforanowego i 973 ml wody mili-Q
Rosół lizogeniczny (LB)	USBiologiczne nauki przyrodnicze	L1520
S Podstawowy			Ilość na litr: 5,85 grama chlorku sodu, 6 gramów fosforanu monopotasowego, 1 gram fosforanu dipotasowego i 1 litr wody mili-Q
Agar	USBiologiczne nauki przyrodnicze	Nr kat. A0930
Chlorek sodu	USBiologiczne nauki przyrodnicze	Zobacz materiał S5000
Pepton	USBiologiczne nauki przyrodnicze	Zobacz materiał P3300
Chlorek wapnia	USBiologiczne nauki przyrodnicze
Siarczan magnezu	Fisher Naukowy	Zobacz materiał M63-500
Bufor fosforanowy			Ilość na litr: 132 ml fosforanu dipotasowego (1 M) i 868 ml fosforanu monopotasowego (1 M)
Fosforan monopotasowy	Acros Organics	7778-77-0
Fosforan dipotasowy	USBiologiczne nauki przyrodnicze	Zobacz materiał P5100