$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Ekspresja bakteryjnych szczepów bioluminescencyjnych
NUTA: Bakteryjne szczepy bioluminescencyjne wymagają specjalnego podłoża wzrostowego/sztucznego podłoża z wodą morską do wzrostu i produkcji światła.
- Przygotować sztuczne podłoże z wodą morską, składające się z dwóch oddzielnie przygotowanych składników pożywki.
NUTA: Poniższe ilości dotyczą 1 l płynnego podłoża lub 1 litra podłoża agarowego.- W przypadku sztucznej pożywki z wodą morską należy odważyć następujące sole: 28,13 g NaCl (chlorek sodu), 0,77 g KCl (chlorek potasu), 1,60 g CaCl2 · 2H2O (dwuwodny chlorek wapnia), 4,80 g MgCl2 · 6H2O (sześciowodny chlorek magnezu), 0,11 gNaHCO3 (wodorowęglan sodu) i 3,50 gMgSO4 · 7H2O (siarczan magnezu siedmiowodny).
- Dodać 1 l wody destylowanej i rozpuścić wszystkie składniki.
- W przypadku podłoża LB (Luria-Bertani) należy dodać następujące składniki: 10 g ekstraktu drożdżowego, 10 g peptonu, a na płytki agarowe dodatkowe 20 g agaru.
- Dodaj 250 ml wody z kranu i rozpuść składniki.
- Oba przygotowane podłoża należy sterylizować w autoklawie oddzielnie w temperaturze 121 °C przez 20 minut.
- W przypadku płytek agarowych należy połączyć 250 ml pożywki LB z 750 ml pożywki ze sztucznej wody morskiej bezpośrednio po autoklawowaniu i przygotować płytki.
- W przypadku pożywki płynnej należy połączyć 250 ml pożywki LB z 750 ml pożywki ze sztucznej wody morskiej bezpośrednio po autoklawowaniu lub po schłodzeniu.
NUTA: Sztuczne podłoże wody morskiej może stać się mętne w wyniku wytrącania się soli.
- Szczepy bioluminescencyjne bakterii należy rozprowadzić na płytkach agarowych ze sztucznej wody morskiej i inkubować przez noc w temperaturze 24 - 30 °C.
NUTA: Długotrwałe przechowywanie szczepów bakteryjnych odbywa się zwykle poprzez zamrażanie zapasów glicerolu w kulturze bakteryjnej. Szczepy należy zawsze najpierw rozsiać na płytkach agarowych, aby zapewnić jednolite warunki początkowe dla wszystkich szczepów, przed użyciem do kultur płynnych, ze względu na opóźnioną fazę wzrostu po rozmrożeniu. - Przygotuj ONC (hodowlę przez noc), zaszczepiając 100 ml sztucznego podłoża z wodą morską pojedynczą kolonią z płytki. Inkubować ONC w temperaturze 24 - 30 °C i 120 obr./min w wytrząsarce inkubatora przez noc.
- Zaszczepić 800 ml sztucznej pożywki z wodą morską za pomocą 8 ml ONC.
- Inkubować komórki bakteryjne w temperaturze 24 - 30 °C i prędkości 120 obr./min w wytrząsarce inkubatora.
NUTA: Profil natężenia światła bakterii bioluminescencyjnych silnie zmienia się wraz z temperaturą. W zależności od mechanizmów regulacyjnych produkcji światła przez dany szczep bakterii, emisja światła może rozpocząć się po około 1 - 6 godzinach. - Obserwuj hodowlę komórek bakteryjnych, aż zaczną świecić (około 1 - 6 godzin).
NUTA: W zależności od celu ekspresji, komórki są hodowane do następnego dnia, a następnie zbierane lub komórki mogą się trząść tak długo, jak długo świecą. Pobieranie komórek i oczyszczanie wszelkich białek można przeprowadzić zgodnie ze standardowymi procedurami.