Mikroskopowa analiza wzrostu bakterii pod wpływem stresu przy użyciu komór mikroprzepływowych

Streszczenie

Źródło: Cayron, J., et al. Wieloskalowa analiza wzrostu bakterii w warunkach leczenia stresem. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film pokazuje, jak przygotować i wykorzystać płytkę mikroprzepływową do obrazowania komórek bakteryjnych w warunkach stresu. Przedstawia proces wprowadzania kultury bakteryjnej i wywołującej stres pożywki antybiotykowej, a następnie ładowania komórek i ustawiania mikroskopu. Obrazowanie poklatkowe w trybie kontrastu fazowego jest następnie wykorzystywane do obserwacji rozwoju wydłużonych, nitkowatych komórek o zwiększonej zawartości DNA z powodu zahamowania podziałów komórkowych.

Protokół

1. Mikrofluidyka obrazowanie poklatkowe
   1. Usunąć roztwór konserwujący z płytki mikroprzepływowej i zastąpić go świeżym podłożem podgrzanym do temperatury 37 °C, zgodnie z opisem w instrukcji obsługi oprogramowania mikroprzepływowego.
   2. Uszczelnij płytkę mikroprzepływową do układu kolektora i kliknij przycisk Zalewanie.
   3. Umieścić płytkę mikroprzepływową z układem kolektora na stoliku mikroskopowym i podgrzać w temperaturze 37 °C przez ~2 godziny przed rozpoczęciem akwizycji mikroskopowej.
      NUTA: Ten etap podgrzewania ma kluczowe znaczenie, aby uniknąć dylatacji komory mikroprzepływowej, która zmieniłaby ostrość mikroskopu podczas eksperymentu poklatkowego i pogorszyłaby akwizycję obrazu.
   4. Uszczelnij płytkę mikroprzepływową. Zastąp pożywkę z dołka 8 150 μl próbki hodowli i zastąp pożywkę z dołka 1 do 5 żądanym podłożem z odczynnikiem wywołującym stres lub bez niego.
   5. Uszczelnij płytkę mikroprzepływową i umieść ją na stoliku mikroskopu.
   6. W oprogramowaniu mikroprzepływowym uruchom procedurę ładowania komórki. Sprawdź, czy obciążenie komórek jest zadowalające, patrząc pod mikroskop w świetle przechodzącym. Uruchom procedurę ładowania komórek po raz drugi, jeśli gęstość komórek w komorze jest niewystarczająca.
   7. Wykonaj staranne ustawienie ostrości w trybie światła przechodzącego i wybierz kilka pól view, które pokazują izolowane bakterie. Ważne jest, aby wybrać pola, które nie są przepełnione, aby móc monitorować wzrost izolowanych komórek w czasie (zalecane jest ~10–20 komórek na 100 μm²). Ułatwi to również wykrywanie komórek podczas analizy obrazu.
   8. W oprogramowaniu mikroprzepływowym kliknij przycisk Utwórz protokół. Zaprogramuj wstrzyknięcie pożywki wzrostowej dla 1-2 ekwiwalentów czasu generacji, aby umożliwić komórkom adaptację (opcjonalnie). Następnie zaprogramuj wstrzyknięcie medium wywołującego stres w ciągu 10 minut przy 2 psi, a następnie wstrzyknięcie przy 1 psi na żądany czas leczenia stresu. Jeśli zamierzasz przeanalizować regenerację komórek po stresie, zaprogramuj wstrzykiwanie świeżej pożywki wzrostowej na żądany czas.
      NUTA: W przedstawionym tutaj eksperymencie cefaleksynę wstrzykiwano na 10 minut przy 2 psi, a następnie 50 minut przy 1 psi. Następnie wstrzyknięto świeżą pożywkę wzrostową przy 2 psi przez 10 minut, a następnie przez 3 godziny przy 1 psi.
   9. Wykonuj obrazowanie mikroskopowe w trybie poklatkowym z 1 klatką co 10 minut, używając kontrastu fazowego w świetle przechodzącym i źródła światła wzbudzającego 560 nm dla sygnału mCherry, jeśli jest to wymagane.
      NUTA: Ważne jest, aby rozpocząć akwizycję obrazu mikroskopowego w tym samym czasie, co rozpoczęcie protokołu iniekcji mikroprzepływowej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
System mikroprzepływowy CellASIC ONIX	Merck Millipore	CAX2-S0000	Układ mikroprzepływowy
CellASIC ONIX2 FG	Merck Millipore	ONIX2 1.0.1	Oprogramowanie mikroprzepływowe
Rozdzielacz CellASIC ONIX2 Basic	Merck Millipore	CAX2-MBC20	System rozdzielaczy
Szczep E. coli przenoszący insercję chromosomową w celu fuzji hupA-mCherry			Stworzony przez transdukcję P1 hupA-mCherry w E. coli MG1655
Płytki mikroprzepływowe CellASIC ONIX	Merck Millipore	Zobacz materiał B04A-03-5PK	Płytka do układu mikroprzepływowego
Mikroskop Nikon eclipse Ti	Nikon		Mikroskop fluorescencyjny
MOPS EZ Rich Defined Medium (RDM)	Teknova	Zobacz materiał M2105	Pożywka bogata w wzrost, 10x Mieszanina MOPS, 0,132 M K₂HPO₄, 10x AGCU, 5x Suplement EZ, 20% Glukozy. Filtrowane z prędkością 0,22 μm