Ocena roju bakterii za pomocą gradientowej płytki inhibitora

Streszczenie

Źródło: Guo, S., et al. Kwantyfikacja ruchliwości roju powierzchni bakterii na płytkach gradientu induktora. J. Vis. Exp. (2022).

Ten film demonstruje wykorzystanie dwuwarstwowej gradientowej płyty roju do badania zachowania roju bakterii przy różnych stężeniach inhibitorów. Płytkę z inhibitorem tworzącym gradient w dolnej warstwie zaszczepia się bakteriami i inkubuje. Obrazy są rejestrowane w regularnych odstępach czasu w celu analizy wpływu stężenia inhibitora na rozprzestrzenianie się bakterii.

Protokół

1. Przygotowanie gradientowych płyt roju

1. Przygotowanie podłoża roju
   UWAGA: W tym protokole zastosowano 0,7% (w/v) stężenie agaru w pożywce roju.
   1. Przygotować bulion lizogeniczny (LB) w proszku z agarem w dwóch stożkowych kolbach; Każda kolba zawiera 2 g tryptonu, 2 g chlorku sodu (NaCl), 1 g ekstraktu drożdżowego i 1,4 g agaru. Dodać podwójnie destylowaną wodę (ddH₂O) i wymieszać zawiesinę za pomocą mieszadła magnetycznego. Dostosować końcową objętość do 200 ml, dodając dodatkowo ddH₂O.
   2. Roztwór należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 min. Użyj przepuszczającej powietrze nakrętki lub folii uszczelniającej butelkę z odpowietrznikiem.
      UWAGA: Agar rozpuści się po podgrzaniu w autoklawie.
   3. Gdy temperatura spadnie do 65 °C, wymieszaj roztwór, aby zapewnić jednorodność, a następnie przenieś pożywkę do inkubatora o temperaturze 65 °C lub łaźni wodnej w celu krótkotrwałego użycia.
2. Przygotowanie podłoża rojowego w dolnej warstwie
   UWAGA: Pożywka w dolnej warstwie jest mieszaniną pożywki rojowej i roztworów podstawowych induktora. Formułę płytek roju gradientu induktora przedstawiono w tabeli 1.
   1. Przygotować 100 mM roztwór podstawowy resweratrolu, rozpuszczając 114,12 mg liofilizowanego proszku resweratrolu w 5 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) i przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C.
   2. Przygotować 20% (w/v) roztwór podstawowy arabinozy, rozpuszczając 6 g proszku arabinozy w 30 ml ddH₂O; Odczekaj 10-15 minut, aby arabinoza się rozpuściła; i przechowywać roztwór w temperaturze pokojowej.
   3. Wyjąć pożywkę z inkubatora o temperaturze 65 °C i umieścić ją w temperaturze pokojowej; pozostawić pożywkę roju do ostygnięcia, aż kolba Erlenmeyera ostygnie na tyle, aby utrzymać temperaturę (~50 °C). Nie umieszczaj pożywki roju w temperaturze pokojowej przez dłuższy czas, ponieważ spowoduje to zestalenie się agaru.
   4. Dodać wymaganą objętość roztworu podstawowego induktora do pożywki roju w temperaturze 50 °C (tabela 1). Użyj pipety, aby dozować roztwór induktora zamiast go nalewać. Delikatnie zamieszaj, aby wymieszać induktor z podłożem roju.
      UWAGA: Ten krok dotyczy induktorów, których nie można sterylizować w autoklawie. Uważaj, aby nie wprowadzić bąbelków do podłoża.
3. Przygotowanie dwuwarstwowych płyt roju gradientowego
   UWAGA: Pożywka wierzchniej warstwy to pożywka LB zawierająca 0,7% (w/v) agaru.
   1. Oznacz kwadratowe szalki Petriego o wymiarach 13 x 13 cm nazwą induktora i szczepami, a następnie podeprzyj szalki nad krawędzią pokrywek (Rysunek 1B).
   2. Dodać 40 ml ciepłej pożywki dolnej warstwy (50 °C) za pomocą pipety o pojemności 50 ml lub probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Alternatywnie, w przypadku kwadratowych szalek Petriego o wymiarach 13 x 13 cm, odpowiednie jest 40 ml podłoża z dolnej i górnej warstwy; W przypadku kwadratowych szalek Petriego o wymiarach 10 x 10 cm odpowiednia jest pożywka dolna i górna warstwa o pojemności 25 ml.
   3. Pozostawić podłoże dolnej warstwy do utwardzenia bez przykrycia przez 1 godzinę w okapie z przepływem laminarnym. Nie naruszaj kwadratowych szalek Petriego, dopóki podłoże nie zestala się.
      UWAGA: Podczas utwardzania dolnej warstwy, podłoże roju niezawierające induktorów powinno być utrzymywane w inkubatorze lub łaźni wodnej o temperaturze 65 °C.
   4. Gdy dolna warstwa całkowicie zastygnie, zdejmij pokrywki i umieść kwadratowe szalki Petriego w okapie z przepływem laminarnym.
   5. Dodać 40 ml ciepłej pożywki wierzchniej warstwy (50 °C) za pomocą pipety o pojemności 50 ml lub probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Podłoże wierzchnie nie zawiera induktorów.
   6. Utwardź dwuwarstwowe płytki na blacie, przykryte i nienaruszone przez 1 godzinę. Przygotowane płytki należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 24 godzin. UWAGA: Dłuższy czas utwardzania zmniejszyłby zawartość wilgoci i ograniczyłby ruchliwość roju.

2. Wzrost E. coli K12 i P. aeruginosa PAO1

1. Przygotować 500 ml pożywki LB, dodając 5 g tryptonu, 5 g NaCl i 2,5 g ekstraktu drożdżowego do ddH₂O i uzupełnić roztwór do 500 ml. Roztwór należy sterylizować w autoklawie w cyklu ciekłym przez 20 minut w temperaturze 121 °C i przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Przygotować 100 ml 1,5% (w/v) pożywki LB-agar, dodając 1 g tryptonu, 1 g NaCl, 0,5 g ekstraktu drożdżowego i 1,5 g agaru do ddH₂O i uzupełnić roztwór do 100 ml. Roztwór należy sterylizować w autoklawie w cyklu cieczy przez 20 minut w temperaturze 121 °C. Przenieść podłoże do łaźni wodnej o temperaturze 50 °C, aby zapobiec zestaleniu się agaru.
3. Gdy kolba z pożywką LB-agar jest wygodna do trzymania, dodać 20 ml pożywki LB-agar do szalki Petriego (o średnicy 10 cm) za pomocą pipety o pojemności 25 ml. Pozostawić płytkę w temperaturze pokojowej na noc i przechowywać płytkę LB-agar w temperaturze 4 °C.
4. Pobrać kultury zapasowe przechowywane w temperaturze -80 °C, szczepy E. coli K12, E. coli K12-YdeH, P. aeruginosa PAO1 i P. aeruginosa PAO1-YdeH na szalkach Petriego LB-agar za pomocą jednorazowych pętli inokulacyjnych. Inkubować odwrócone szalki Petriego przez noc w temperaturze 37 °C.
5. Z szalek Petriego należy wybrać pojedyncze kolonie dla różnych szczepów, zaszczepić każdą kolonię w 5 ml pożywki LB i inkubować kulturę w temperaturze 37 °C w laboratoryjnej wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 220 obr./min.
6. Gdy gęstość kultury osiągnie OD600nm ~ 1,0, wyjmij kulturę z wytrząsarki i umieść ją w temperaturze pokojowej. Dostosuj gęstość hodowli do OD600nm = 1,0, zgodnie z opisem w kroku 3.2.1.

3. Inokulacja i inkubacja gradientowych płytek roju

1. Przygotowanie studzienek inokulacyjnych
   UWAGA: Zamiast metody opisanej poniżej można zastosować modele pokryw do drukowania 3D, które są w stanie generować studzienki oddzielone standardową odległością.
   1. Zaznacz pozycje studzienek na papierze A4, jak pokazano na rysunku 1C. Ustawić trzy badane stężenia na jednej kwadratowej szalce Petriego z dwoma lub trzema powtórzeniami.
   2. Umieść oznaczony papier A4 pod zastygłą płytą gradientową. Wsunąć szerszą stronę końcówki pipety o pojemności 100 μl w półstałą powierzchnię podłoża w zaznaczonym miejscu. Dociśnij końcówkę pipety, aż dotrze do dolnej części wierzchniej warstwy podłoża.
   3. Gdy końcówka dotknie dna, nie przykładaj do niej siły pionowej; Delikatnie obróć końcówkę, aby odizolować zawartość cylindrycznej studzienki.
   4. Przesuwaj poziomo końcówki pipet na bardzo małą odległość, aby umożliwić przepływ powietrza do wąskiej przestrzeni odłożonej na bok. Naciśnij końcówkę palcem wskazującym, aby zablokować przepływ gazu wewnątrz końcówki, jednocześnie trzymając pipetę kciukiem i palcem środkowym.
   5. Wyciągnij końcówkę pionowo, trzymając zawartość studzienki w końcówce podczas jej wyciągania.
      UWAGA: Jeśli zawartość studzienki ześlizgnie się, lekko mocniej dociśnij palcem wskazującym, aby całkowicie uszczelnić końcówkę.
   6. Powtórz kroki od 3.1.2 do 3.1.5 w każdej zaznaczonej pozycji. Przykryj płytkę roju przed inokulacją.
2. Inokulacja i inkubacja na płytkach gradientowych
   1. Dostosuj gęstość kultur wzrostu przez noc do OD600nm = 1,0.
   2. Odpipetować 80 μl nocnej kultury wzrostu do każdej studzienki. Nie wylewaj kultury bakteryjnej na zewnątrz studzienek.
   3. Owiń płytki folią uszczelniającą. W przypadku długotrwałej obserwacji (3-5 dni) owiń płytki sterylną taśmą z gumy laboratoryjnej.
      UWAGA: Taśma gumowa jest mniej podatna na pękanie.
   4. Umieścić zlewkę wypełnioną ddH₂O w inkubatorze, aby utrzymać wilgotność wewnątrz inkubatora. Inkubować płytki roju gradientowego w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Nie inkubuj płytek roju do góry nogami; Spowoduje to wyciek kultury bakteryjnej ze studzienek.
   5. Wyobraź sobie płytkę roju natychmiast po zaszczepieniu, rejestrując to jako punkt czasowy 0 godzin.

4. Obrazowanie roju powierzchni bakterii

1. Płytki roju wyjmować pojedynczo z inkubatora co 12 godzin, trzymając płytkę poziomo, i umieszczać je w systemie obrazowania żelu (patrz tabela materiałów).
   UWAGA: Nie pozostawiaj odcisków palców na powierzchni tablic; Trzymaj bok płyty roju czystymi rękawicami.
2. Wybierz tryb obrazowania żelu ; wystaw płytkę roju na działanie białego światła; i dostosuj ogniskową, aby uzyskać jak najwyraźniejszy widok rojów.
   UWAGA: Używaj tej samej ogniskowej dla wszystkich płyt w danej partii.
3. Zwiększ jasność rojów, aby uzyskać wyraźną obserwację, dostosowując czas ekspozycji do 300 ms. Dostosuj próg , aby zminimalizować zakłócenia powodowane przez światło tła.
   UWAGA: Próg jest regulowany w interfejsie operacyjnym systemu obrazowania żelu. Zwiększ wartości po lewej stronie, aby zminimalizować zakłócenia powodowane przez światło tła; Zmniejsz wartości po prawej stronie, aby zwiększyć jasność rojów. W tym protokole region wynosi zwykle od 6 000 do 50 000.
4. Zapisz plik obrazu do dalszej analizy. Zapisz czas obrazowania, typ induktora, orientację gradientu i odkształcenia w pliku .txt .

 

Tabela 1: Specyfikacja dwuwarstwowego podłoża roju.

Pożywka górna warstwa/pożywka bulionowa lizogenna (na 100 ml)
Trypton: 1 g
Chlorek sodu: 1 g
Ekstrakt drożdżowy: 0,5 g
Agar: 0,7 g
Pożywka dolnej warstwy/pożywka zawierająca induktor (na 100 ml)
Trypton: 1 g	Stężenie robocze:	Stężenie roztworu podstawowego:
Chlorek sodu: 1 g
Ekstrakt drożdżowy: 0,5 g	- Resweratrol: 400 μM	- Resweratrol: 100 mM
Agar: 0,7 g
Induktorem:	- Arabinoza: 0,5% (w/v)	- Arabinoza: 20% (w/v)
- Roztwór podstawowy resweratrolu: 400 μL	lub 1% (w/v)
- Roztwór podstawowy arabinozy: 2,5 ml lub 5 ml

Wyniki

Rysunek 1: Schemat przygotowania, inokulacji i inkubacji płytki roju gradientu induktora. (A) Nocny wzrost kultury bakteryjnej w temperaturze 37 °C. (B) Przebieg pracy dwuwarstwowej płyty roju gradientu induktora. i) Podeprzyj kwadratowe sza...

Materiały