Kolorymetryczne wykrywanie degradacji kory mózgowej podczas kiełkowania przetrwalników bakteryjnych

Streszczenie

Źródło: Franciszek, M. B., et al. Wykrywanie fragmentów kory mózgowej podczas kiełkowania zarodników bakterii. J. Vis. Exp. (2016).

Ten film przedstawia kolorymetryczną metodę wykrywania degradacji kory podczas kiełkowania przetrwalników bakterii poprzez pomiar uwalniania cukrów redukujących w czasie. Wykorzystując wzorce N-acetyloglukozaminy i próbki punktów czasowych, test określa ilościowo stężenie cukru w wyniku fioletowej reakcji chromogennej, wskazując zakres hydrolizy kory.

Protokół

1. Odczynnik barwny

1. Gdy próbki znajdują się na lodzie, przygotuj odczynnik barwiący. Rozpuścić 0,320 g p-dimetyloaminobenzaldehydu (DMAB; Odczynnik Ehrlicha) w 1,9 ml lodowatego kwasu octowego.
   Nuta: Odczynnik jest wrażliwy na czas, temperaturę i światło i nie powinien być wykonywany z wyprzedzeniem.
2. Po całkowitym rozpuszczeniu DMAB dodać 100 μl 10 N HCl i odwirować.
3. Dodać 5 ml lodowatego kwasu octowego i odwirować.

2. Reakcja kolorymetryczna

1. Przenieś 100 μl każdej schłodzonej próbki kory do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
2. Do każdej próbki dodać 700 μl świeżo przygotowanego roztworu barwnego.
3. Natychmiast przenieść próbki do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować DOKŁADNIE przez 20 minut.
4. Przenieść 200 μl każdej próbki na przezroczystą 96-dołkową płytkę.
5. Oznacz ilościowo próbki przy długości fali 585 nm na czytniku płytek. Próbki powinny zaczynać się od żółtego koloru, a pozytywna reakcja zmieni się w fioletową. Im więcej kory mózgowej, tym głębszy fioletowy kolor.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rurka z nakrętką 2,0 ml	Amerykański naukowiec	1420-3700
P1000 Eppendorf Pippet	Eppendorf powiedział:
P200 Eppendorf Pippet	Eppendorf powiedział:
P20 Eppendorf Pippet	Eppendorf powiedział:
Końcówki do pipet 100-1250 uL	Firma VWR	89079-486
Końcówki do pipet 1-200 uL	Firma VWR	89079-458
N-acetylo-D-glukozamina	Sigma	A3286-25G
Bezwodnik octowy	Alfa Aesar	L04295
Wodorowęglan sodu	BDH (Międzynarodowa Organizacja T	BDH0280-500G
Tetraboran potasu czterowodny	Alfa Aesar	39435
Wodorotlenek sodu	BDH (Międzynarodowa Organizacja T	BDH8019-500G
4-(dimetyloamino)benzaldehyd	Sigma	156477-100G
SpectraMax M3	Urządzenia molekularne
Kwas octowy, lodowcowy	BDH (Międzynarodowa Organizacja T	BDH3098-3,8 LP
Podgrzewana, obiegowa kąpiel wodna	VWR Scientific	nr wzoru 1136
Mikrotest 96	Sokół	353072
Probówki hodowlane	Firma VWR	89000-506	96 dobrze przezroczystych płytek do hodowli tkankowych
Bloki cieplne
Maszyna wirowa