Produkcja i odzyskiwanie białek rekombinowanych z pęcherzyków pochodzących od bakterii

Streszczenie

Źródło: Streather, B. R., et al. Zoptymalizowana produkcja i analiza rekombinowanych pęcherzyków wypełnionych białkiem z E. coli. J. Vis. Exp. (2023)

Ten film pokazuje produkcję i izolację rekombinowanych białek oznaczonych peptydem zarodkującym pęcherzyki (VNp) z pęcherzyków bakteryjnych. Induktor wyzwala ekspresję białka znakowanego VNp, napędzając tworzenie pęcherzyków i enkapsulację, a następnie wirowanie i sonikację w celu wydajnego odzyskiwania białka bez lizy komórek

Protokół

1. Hodowla komórek bakteryjnych i indukcja białek

1. Aby indukować ekspresję białka rekombinowanego z promotora T7, należy dodać izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG) do końcowego stężenia do 20 μg/ml (84 μM). Indukcja ekspresji białka rekombinowanego musi nastąpić w późnej fazie logarytmicznej (tj. Typowa gęstość optyczna, OD₆₀₀ 0,8-1,0) w celu wytworzenia pęcherzyków. ​
   NUTA: Długość okresu indukcji może się różnić w zależności od białka, przy czym niektóre osiągają maksymalną produkcję po 4 godzinach, a inne w ciągu nocy (18 godzin). Do tej pory maksymalny eksport pęcherzyków uzyskiwano w kulturach nocnych.

2. Rekombinowana izolacja pęcherzyków

1. Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze 3 000 x g (4 °C) przez 20 minut.
2. Aby wysterylizować pożywkę zawierającą pęcherzyki do długotrwałego przechowywania, należy przepuścić oczyszczoną pożywkę hodowlaną przez sterylny i bezdetergentowy filtr polieterosulfonowy (PES) 0,45 μm.
   NUTA: W celu zbadania wykluczenia żywych komórek z filtratu zawierającego pęcherzyki, należy umieścić na agarze z bulionu lizogennego (LB) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
3. Aby zagęścić pęcherzyki w mniejszej objętości, przepuść sterylne podłoże zawierające pęcherzyki przez sterylny i wolny od detergentów filtr 0,1 μm mieszanych estrów celulozy (MCE).
4. Delikatnie umyj membranę 0,5-1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) za pomocą skrobaka do komórek lub plastikowego rozsiewacza, aby ostrożnie usunąć pęcherzyki z membrany. Przenieś do świeżej probówki do mikrofuge. ​
   NUTA: Oczyszczone pęcherzyki można przechowywać w sterylnych pożywkach lub PBS w temperaturze 4 °C. Istnieją przykłady rekombinowanych białek przechowywanych w tych pęcherzykach przez 6 miesięcy, w ten sposób bez utraty aktywności enzymatycznej.

3. Uwalnianie rozpuszczalnego białka z izolowanych pęcherzyków

1. Po wyizolowaniu pęcherzyków zawierających białko w sterylnym pożywce/buforze, należy poddać błony lipidowe pęcherzyków sonikacji, stosując odpowiedni harmonogram dla aparatu (np. 6 x 20 s cykli włączania i wyłączania) i odwirować przy 39 000 x g (4 °C) przez 20 minut w celu usunięcia resztek pęcherzyków. NUTA: Szok osmotyczny lub detergent mogą być stosowane jako alternatywa w celu rozbicia pęcherzyków, ale należy wziąć pod uwagę wpływ na funkcjonalność białka i/lub dalsze zastosowanie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)	Szczecin	367-93-1
Rosół lizogeniczny (LB) / agar LB	Kolba laboratoryjna	NIE	10 g/l tryptonu; 10 g/l NaCl; 5 g/l ekstraktu drożdżowego (1,5 g/l agaru)
MF-Millipore Filtr membranowy (0,1 μm, MCE)	Merck	VCWP04700
Filtr membranowy Millipore Express PLUS (0,45 μm, PES)	Merck	HPWP04700
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Kolba laboratoryjna	NIE