F Transfer plazmidu i podwójna selekcja antybiotyków w E. coli

Streszczenie

Źródło: Erdogan, F. i wsp., Testy kojarzenia koniugacyjnego do specyficznej dla sekwencji analizy białek transferowych zaangażowanych w koniugację bakteryjną. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film przedstawia procedurę przenoszenia plazmidu F od dawcy do biorcy komórek E. coli przy użyciu plazmidu ratunkowego i selekcji transkoniugantów poprzez podwójną oporność na antybiotyki. Proces obejmuje mieszanie kultur bakteryjnych, inkubację bez wstrząsania, przerywanie par kojarzeniowych i posiewanie na selektywnych pożywkach w celu potwierdzenia udanego transferu plazmidu.

Protokół

1. Test krycia koniugacyjnego od dawców XK1200 do biorców MC4100

1. Przygotować kulturę O/N komórek XK1200 pOX38-Tc Δgene::Cm + pK184-gen w 20 ml sterylnego bulionu lizogenicznego (LB) z 20 μg/ml chloramfenikolu (Cm), 50 μg/ml kanamycyny (Km) i komórek MC4100 w 5 ml LB z 50 μg/ml streptomycyny (Sm) przy użyciu komórek z glicerolu lub pojedynczej kolonii na płytce agarowej i sterylnej pipecie lub pętli. Hoduj kultury w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem 200 obr./min.
2. Wykonać rozcieńczenia w stosunku 1:70 z każdej kultury O/N oddzielnie w 2 ml sterylnego LB z tymi samymi antybiotykami. Dodać glukozę do końcowego stężenia 100 mM do wszystkich komórek dawcy. Hodować komórki do środkowej fazy logarytmicznej (OD₆₀₀ 0,5-0,7) w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
3. Odwirować (4 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C) w celu osadzenia komórek, wyrzucić supernatant, przemyć raz zimnym sterylnym LB w celu usunięcia antybiotyków i ponownie zawiesić komórki w 2 ml zimnego sterylnego LB.
4. Powtórzyć 100 μl każdej kultury na 800 μl sterylnej pożywki LB i pozostawić do połączenia w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę bez wstrząsania.
5. Wiruj komórki przez 30 sekund, aby zakłócić par godowych i umieść je na lodzie na 10 minut, aby zapobiec dalszemu kryciu.
6. Używając wirowanej mieszaniny i świeżego sterylnego LB, przygotować 6 rozcieńczeń (^10-2 do ^10-7) transkoniusantów. Dla transkoniugantu MC4100 wybrać komórki Δgen::Cm pOX38-Tc::Cm, zaznaczając 10 μl podwielokrotności każdego rozcieńczenia na każdej połówce płytek agarowych zawierających 50 μg/ml Sm i 20 μg/ml Cm, jak pokazano na rysunku 1. Powtórz dla obu zduplikowanych mieszanin. Utrzymuj obszar w sterylnym stanie i pracuj w pobliżu płomienia. Inkubować płytki O/N w temperaturze 37 °C.

Wyniki

Rycina 1: Test krycia w celu oceny funkcji genu docelowego w koniugacji. Komórkami dawcy i biorcy były E. coli XK1200 pOX38-Tc ΔtraF::Cm przekształcone odpowiednio za pomocą pK184-TraF i MC4100. Powstałe w ten ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szalki Petriego	Fisher Naukowy	FB0875713
Antybiotyki			Stężenia końcowe
Chloramfenikol (cm)	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP904-100	20 μg/ml
Kanamycyna (km)	BioBasic Inc.	DB0286 (wersja angielska)	50 μg/ml
Streptomycyna (Sm)	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP910-50	50 μg/ml