F Transfer plazmidu i podwójna selekcja antybiotyków w E. coli

Streszczenie

Źródło: Erdogan, F. i wsp., Testy kojarzenia koniugacyjnego do specyficznej dla sekwencji analizy białek transferowych zaangażowanych w koniugację bakteryjną. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film przedstawia procedurę przenoszenia plazmidu F od dawcy do biorcy komórek E. coli przy użyciu plazmidu ratunkowego i selekcji transkoniugantów poprzez podwójną oporność na antybiotyki. Proces obejmuje mieszanie kultur bakteryjnych, inkubację bez wstrząsania, przerywanie par kojarzeniowych i posiewanie na selektywnych pożywkach w celu potwierdzenia udanego transferu plazmidu.

Protokół

1. Test krycia koniugacyjnego od dawców XK1200 do biorców MC4100

1. Przygotować kulturę O/N komórek XK1200 pOX38-Tc Δgene::Cm + pK184-gen w 20 ml sterylnego bulionu lizogenicznego (LB) z 20 μg/ml chloramfenikolu (Cm), 50 μg/ml kanamycyny (Km) i komórek MC4100 w 5 ml LB z 50 μg/ml streptomycyny (Sm) przy użyciu komórek z glicerolu lub pojedynczej kolonii na płytce agarowej i sterylnej pipecie lub pętli. Hoduj kultury w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem 200 obr./min.
2. Wykonać rozcieńczenia w stosunku 1:70 z każdej kultury O/N oddzielnie w 2 ml sterylnego LB z tymi samymi antybiotykami. Dodać glukozę do końcowego stężenia 100 mM do wszystkich kom....

Wyniki

Rycina 1: Test krycia w celu oceny funkcji genu docelowego w koniugacji. Komórkami dawcy i biorcy były E. coli XK1200 pOX38-Tc ΔtraF::Cm przekształcone odpowiednio za pomocą pK184-TraF i MC4100. Powstałe w ten .......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szalki Petriego	Fisher Naukowy	FB0875713
Antybiotyki			Stężenia końcowe
Chloramfenikol (cm)	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP904-100	20 μg/ml
Kanamycyna (km)	BioBasic Inc.	DB0286 (wersja angielska)	50 μg/ml
Streptomycyna (Sm)	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP910-50	50 μg/ml