Inaktywacja bakterii za pomocą aktywowanego światłem mononukleotydu flawinowego

Streszczenie

Źródło: Cheng, C., et al. Inaktywacja patogenów poprzez fotolizę ryboflawiny-5′-fosforanu w świetle widzialnym. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film przedstawia metodę oceny fototoksycznego wpływu mononukleotydu flawinowego (FMN) na bakterie chorobotwórcze. Kultury bakteryjne są wystawione na działanie rosnących stężeń FMN i oświetlone światłem widzialnym w celu wytworzenia reaktywnych form tlenu (ROS), które uszkadzają składniki komórkowe. Bakterie, które przeżyły, są następnie oznaczane ilościowo w celu oceny zależnego od dawki zmniejszenia żywotności.

Protokół

1. Żywotność Staphylococcus aureus (S. aureus) po fotolizie FMN (ryc. 1)
   1. Przenieś kolonię S. aureus (BCRC 10451) z płytki hodowlanej do 10 ml bulionu lizogenicznego pobranego w 15 ml zakręconej probówki. Hodowla w shakerze w temperaturze 37°C przez 16 godzin.
   2. Przenieść 0,5 ml kultury do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodaj wysterylizowaną wodę do probówki wirówkowej, aby rozcieńczyć kulturę do gęstości optycznej 0,5 przy 600 nm (OD₆₀₀) (~6 x 10⁷ jednostka tworząca kolonie [CFU]/ml).
   3. Przenieść 0,5 ml kultury do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml, odwirować przy 14 000 x g przez 10 minut i zdekantować supernatant w celu uzyskania osadu komórkowego.
   4. Dodać 1 ml ryboflawino-5'-fosforanu (lub mononukleotydu flawinowego; FMN) roztwór buforowany (30, 60 i 120 μM FMN w buforze fosforanu potasu [PB]) do osadów komórkowych otrzymanych jak w kroku 1.3 i wirować. W celu kontroli napromienianej dodać 1 ml samego PB.
   5. Przenieść po 1 ml każdego z żywych roztworów komórek bakteryjnych zawierających 30 μM FMN i PB samodzielnie do szklanych probówek i naświetlić je światłem fioletowym o sile 10 W/^m2 przez 30 minut.
   6. Przenieść po 1 ml każdego z żywotnych roztworów komórek bakteryjnych zawierających 30, 60 i 120 μM FMN i PB do szklanych probówek i naświetlić je niebieskim światłem o mocy 20 W/^m2 przez 120 minut. Ustaw kolejną szklaną probówkę z 1 ml żywego roztworu komórek bakteryjnych zawierającego 120 μM FMN i naświetlaj ją niebieskim światłem o mocy 20 W/^m2 przez 60 minut.
   7. Ustaw probówki zgodnie z opisem w krokach 1.5 i 1.6 i przykryj je grubą folią aluminiową. Te lampy służą jako ciemne elementy sterujące.
   8. Przechowywać komorę napromieniania (jak również ciemne elementy sterujące) w chłodni w temperaturze 9 ± 1 °C podczas 30-120 minutowego okresu napromieniania.
      NUTA: Nie można ignorować ciepła uwalnianego przez diody elektroluminescencyjne (LED), ponieważ chipy LED umieszczone wewnątrz kubka mogą podgrzewać układ fotoreakcji podczas eksperymentów z napromienianiem. Eksperymenty przeprowadzono zatem w chłodni utrzymywanej w temperaturze 9 ± 1 °C.
   9. Po napromienieniu przenieść 0,2 ml z każdego z roztworów reakcyjnych na płytkę z agarem Luria (LA). Rozprowadzić bakterie na płytce za pomocą szklanej pałeczki w kształcie litery L i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
   10. Oblicz żywotną liczbę płytek i szybkość inaktywacji S. aureus po nocnym wzroście.

NUTA: Szybkość inaktywacji S. aureus oblicza się jako procentową redukcję, która jest równa [1 -I / D] ×100%, gdzie I i D oznaczają odpowiednio liczbę CFU w napromieniowanej próbce i ciemnej kontroli. Procentową redukcję definiuje się jako ujemną wartość współczynnika inaktywacji.

Wyniki

Rycina 1: Wpływ fotolizy FMN na żywotność S. aureus. Procentową redukcję definiuje się jako ujemną wartość współczynnika inaktywacji dla S. aureus poddanego działaniu (A) FMN w naświ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Niebieskie, zielone i czerwone diody LED	Vita LED Technologies Co., Tainan, Tajwan		Prąd stały 12 V 5050
Dimetylosulfotlenek	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	190186
Termometr na podczerwień	Raytek Co. Santa Cruz, Kalifornia	Platforma MT4
Rosół LB	Difco Co., Nowy Jork
L-metionina	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	1.05707
NBT (Amerykański Urząd T	Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Kanada
Zasilacz	China tech Co., Nowe Tajpej, Tajwan	YP30-3-2
5′-fosforan ryboflawiny	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	Czynnik R7774
RNaza	New England BioLabs, Inc. Ipswich, Massachusetts
Licznik energii słonecznej	Tenmars Electronics Co., Tajpej, Tajwan	TM-207 powiedział:
Staphylococcus aureus subsp. aureus	Centrum Zbierania i Badań nad Zasobami Biologicznymi (BCRC), Hsinchu, Tajwan	10451
Spektrometr optyczny UV-Vis	Ocean Optics, Dunedin, Floryda	USB4000
Spektrofotometr UV-Vis	Hitachi High-Tech Science Corporation, Tokio, Japonia	U-2900
Fioletowa dioda LED	Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, Chiny