Kwantyfikacja inaktywacji bakterii wywołanej światłem poprzez wytwarzanie reaktywnych form tlenu

Abstract

Źródło: Cheng, C., et al. Inaktywacja patogenów poprzez fotolizę ryboflawiny-5′-fosforanu w świetle widzialnym. J. Vis. Exp. (2022).

Na tym filmie zbuforowana mieszanina reakcyjna zawierająca L-metioninę, błękit nitro tetrazolium (NBT) i mononukleotyd flawinowy (FMN) jest naświetlana światłem fioletowym w celu wywołania produkcji reaktywnych form tlenu (ROS). Prowadzi to do inaktywacji bakterii i powstania wykrywalnego spektrometrycznie formazanu.

Protocol

1. Wykrywanie reaktywnych form tlenu (O₂•⁻) w Staphylococcus aureus

1. Przygotować próbki Staphylococcus aureus .
2. Rozcieńczyć gęstość bakteryjną próbek sterylizowaną wodą do gęstości optycznej 0,5 przy 600 nm (OD (gęstość optyczna) ₆₀₀, ~6 x 10⁶ CFU (jednostka tworząca kolonię) / ml). Przenieść 0,5 ml kultury do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odwirować przy 14 000 x g przez 10 minut i zdekantować supernatant w celu uzyskania osadu komórkowego.
3. Dodaj 0,1093 g L-metioniny, 0,1 g NBT (chlorek tetrazolu nitroniebieskiego) i 25 ml FMN (mononukleotyd flawinowy) (400, 240 lub 120 μM) do 75 ml PB (buforu fosforanowego). Na każdy 1 ml zastosowanego reagenta końcowe stężenia FMN, metioniny i NBT wynoszą odpowiednio 100 (60 lub 30) × ^10-6 M, 7,3 × ^10-3 M i 1,2 × ^10-3 M.
4. Dodać 1 ml każdego roztworu reagenta (tj. o różnych stężeniach FMN) do otrzymanych osadów komórkowych. Naświetlać roztwory światłem fioletowym o mocy 10 W/^m2 przez 10 min.
5. Odwirować mieszaninę przy sile 14 000 x g przez 10 minut i zdekantować supernatant. Zawiesić osad w 1 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) w celu ekstrakcji zredukowanego NBT. Wykryć wytworzone gatunki O₂•⁻ na podstawie absorbancji przy 560 nm.

Materials