Kwantyfikacja inaktywacji bakterii wywołanej światłem poprzez wytwarzanie reaktywnych form tlenu

Streszczenie

Źródło: Cheng, C., et al. Inaktywacja patogenów poprzez fotolizę ryboflawiny-5′-fosforanu w świetle widzialnym. J. Vis. Exp. (2022).

Na tym filmie zbuforowana mieszanina reakcyjna zawierająca L-metioninę, błękit nitro tetrazolium (NBT) i mononukleotyd flawinowy (FMN) jest naświetlana światłem fioletowym w celu wywołania produkcji reaktywnych form tlenu (ROS). Prowadzi to do inaktywacji bakterii i powstania wykrywalnego spektrometrycznie formazanu.

Protokół

1. Wykrywanie reaktywnych form tlenu (O₂•⁻) w Staphylococcus aureus

1. Przygotować próbki Staphylococcus aureus .
2. Rozcieńczyć gęstość bakteryjną próbek sterylizowaną wodą do gęstości optycznej 0,5 przy 600 nm (OD (gęstość optyczna) ₆₀₀, ~6 x 10⁶ CFU (jednostka tworząca kolonię) / ml). Przenieść 0,5 ml kultury do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odwirować przy 14 000 x g przez 10 minut i zdekantować supernatant w celu uzyskania osadu komórkowego.
3. Dodaj 0,1093 g L-metioniny, 0,1 g NBT (chlorek tetrazolu nitroniebieskiego) i 25 ml FMN (mononukleotyd flawinowy) (400, 240 lub 120 μM) do 75 ml PB (buforu fosforanowego). Na każdy 1 ml zastosowanego reagenta końcowe stężenia FMN, metioniny i NBT wynoszą odpowiednio 100 (60 lub 30) × ^10-6 M, 7,3 × ^10-3 M i 1,2 × ^10-3 M.
4. Dodać 1 ml każdego roztworu reagenta (tj. o różnych stężeniach FMN) do otrzymanych osadów komórkowych. Naświetlać roztwory światłem fioletowym o mocy 10 W/^m2 przez 10 min.
5. Odwirować mieszaninę przy sile 14 000 x g przez 10 minut i zdekantować supernatant. Zawiesić osad w 1 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) w celu ekstrakcji zredukowanego NBT. Wykryć wytworzone gatunki O₂•⁻ na podstawie absorbancji przy 560 nm.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dimetylosulfotlenek	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	190186
Termometr na podczerwień	Raytek Co. Santa Cruz, Kalifornia	Platforma MT4
Rosół LB	Difco Co., Nowy Jork
L-metionina	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	1.05707
NBT (chlorek tetrazolu błękitu nitro)	Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Kanada
Zasilacz	China tech Co., Nowe Tajpej, Tajwan	YP30-3-2
5′-fosforan ryboflawiny	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	Czynnik R7774
Licznik energii słonecznej	Tenmars Electronics Co., Tajpej, Tajwan	TM-207 powiedział:
Staphylococcus aureus subsp. aureus	Centrum Zbierania i Badań nad Zasobami Biologicznymi (BCRC), Hsinchu, Tajwan	10451
Spektrometr optyczny UV-Vis	Ocean Optics, Dunedin, Floryda	USB4000
Spektrofotometr UV-Vis	Hitachi High-Tech Science Corporation, Tokio, Japonia	U-2900
Fioletowa dioda LED	Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, Chiny