Określanie skuteczności przeciwbakteryjnej paska polimerowego wypełnionego antybiotykiem

Streszczenie

Źródło: Sekar, A., et al., Nowatorska metoda określania podłużnej aktywności przeciwbakteryjnej materiałów uwalniających leki. J. Vis. Exp. (2023)

Ten film przedstawia test oparty na luminescencji do oceny skuteczności przeciwbakteryjnej paska polimerowego obciążonego antybiotykiem poprzez ilościowe określenie luminescencji sterowanej przez ATP, która zmniejsza się w kulturach bakteryjnych narażonych na działanie antybiotyku.

Protokół

Konfiguracja badania aktywności przeciwbakteryjnej w zależności od czasu

1. Hoduj bakterie przez noc w 1 ml bulionu TSB (bulion sojowy tryptyczny).
2. Rozcieńczyć zawiesinę bakterii wyhodowanych przez noc do 10⁵ CFU/ml w sterylnym MHB (bulion Muellera-Hintona) i sprawdzić liczbę żywotnych bakterii za pomocą jednostek luminescencji przed rozpoczęciem eksperymentu.
3. Umieść pierwotne paski UHMWPE (polietylen o ultrawysokiej masie cząsteczkowej) i paski UHMWPE z lekiem (3 mm x 5 mm x 10 mm) w strzykawce o pojemności 3 ml.
4. Pobrać MHB zawierający 10⁵ jtk/ml do strzykawki przez dołączoną igłę do oznaczenia 1,5 ml, co odpowiada 1,35 ml MHB (Rysunek 1: Krok 1).
5. Umieścić zestaw strzykawki w inkubatorze z wytrząsaniem (100 obr./min) w temperaturze 37 °C do wskazanych punktów czasowych: 6 godzin, dzień 1, dzień 2, dzień 3, dzień 4, dzień 5, dzień 6 i dzień 7 (rysunek 1: krok 2).
6. W każdym wskazanym punkcie czasowym wyjmij zestaw strzykawki i wykonaj test żywotności mikrobiologicznej w czasie rzeczywistym na 100 μl zawiesiny bakteryjnej (Rysunek 1: Krok 3-4).
   1. Wykonaj test oparty na luminescencji przy użyciu białych 96-dołkowych płytek z nieprzezroczystym dnem.
   2. Zmieszać 100 μl rozcieńczonych zawiesin bakteryjnych ze 100 μl odczynnika do oznaczania.
   3. Umieść pokrywkę pokrytą folią aluminiową na przygotowanej 96-dołkowej płytce i inkubuj przez 5 minut przy 100 obr./min, wstrząsając.
   4. Natychmiast zmierz luminescencję za pomocą czytnika mikropłytek, korzystając z następujących ustawień w oprogramowaniu Gen5 3.11.
      1. Kliknij przycisk Nowy , aby skonfigurować protokół w oknie Menedżera zadań .
      2. Wybierz opcję Costar 96 white opaque (Biały nieprzezroczysty ) z menu rozwijanego Typ blachy.
      3. Kliknij Czytaj w menu Wybierz kroki > Działania .
      4. Kliknij Luminescencja w oknie Metoda odczytu. Pozostaw wybrane opcje światłowodu końcowego/kinetycznego i luminescencyjnego odpowiednio w obszarze typu odczytu i typu optyki. Kliknij OK.
      5. Zachowaj ustawienia w oknie Krok odczytu (wzmocnienie = 135; czas integracji = 1 sekunda; wysokość odczytu = 4,5 mm). Kliknij OK.
      6. Okno układu blachy jest wyświetlane jako gotowe do uruchomienia. Zaznacz pole Użyj pokrywy w oknie płyty obciążeniowej i kliknij OK.
      7. Umieść 96-dołkową płytkę w urządzeniu, aby odczytać wartości luminescencji.
7. Określ liczbę żywych bakterii dla punktów czasowych 6 godzin, dnia 1, dnia 2, dnia 3 i dnia 7. Określić CFU (jednostki tworzące kolonie)/ml na podstawie jednostek luminescencji, używając odpowiedniej krzywej wzorcowej.
8. Sprawdzić, czy w próbkach, które wykazały wartości luminescencji poniżej granicy wykrywalności, nie ma żywych bakterii, przeprowadzając metodę płytki rozsiewającej na płytkach TSA (Tryptic soy agar) i inkubując w temperaturze 35 °C przez noc. Następnego dnia sprawdź obecność kolonii.
9. Odwirować pozostałą zawiesinę bakteryjną o stężeniu 10 000 × g przez 10 minut i delikatnie odessać zużytą pożywkę. W przypadku probówek, w których granulki nie są widoczne wizualnie ze względu na przeciwbakteryjne działanie leków, należy pozostawić 100 μl w probówce, aby upewnić się, że niewidoczna osadka nie zostanie zakłócona (Rysunek 1: Krok 5).
10. Ponownie zawiesić granulowane bakterie w świeżym MHB i pobrać zawiesinę bakteryjną z powrotem do tej samej strzykawki przez dołączoną igłę (Rysunek 1: Krok 6).

Wyniki

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie konfiguracji eksperymentalnej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ATCC 12600	Kolekcja kultur typu amerykańskiego, VA, USA
Test żywotności komórek mikrobiologicznych BacTiter-Glo	Promega Corporation, Stany Zjednoczone	Klasa g8231
BD Bacto Tryptyczny bulion sojowy (pożywka sojowo-kazeinowa)	Becton-Dickinson, Stany Zjednoczone	BD 211825	Zakupiony od Fisher Scientific, USA
BD Luer-Lok Strzykawka sterylna, jednorazowa, 3 ml	BD, Stany Zjednoczone	309657
Igła BD 5/8 cala jednorazowego użytku, sterylne, 25 G	BD, Stany Zjednoczone	305122
Odwodnione pożywki hodowlane BD BBL: bulion Mueller Hinton II (dostosowany do kationów)	Becton-Dickinson, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał B12322	Zakupiony od Fisher Scientific, USA
Odwodnione podłoże hodowlane BD Difco: Tryptic Soy Agar (agar fermentacyjny sojowo-kazeinowy)	Becton-Dickinson, Stany Zjednoczone	DF0369-17-6	Zakupiony od Fisher Scientific, USA
Siarczan gentamycyny	Fujian Fukang Pharmaceutical Co., Fuzhou, Chińska Republika Ludowa
Stołowy inkubator wstrząsowy LSE	Corning, Nowy Jork, Stany Zjednoczone
Czytnik płytek (Synergy H1	Biotek, VT, Stany Zjednoczone
Wytrząsarka Innova 2100	New Brunswick Scientific, NJ, Stany Zjednoczone
UHMWPE powiedział:	GUR1020, Celanese, Teksas, Stany Zjednoczone
Chlorowodorek wankomycyny	Fagron, Holandia	804148