Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

neurogeneza korowa: przejście od osiągnięć laboratoryjnych do terapii komórkowych

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

Neurogeneza korowa: przejście od osiągnięć laboratoryjnych do terapii komórkowych

Nazywam się Arnold Krickstein. Jestem dyrektorem Instytutu Medycyny Regeneracyjnej tutaj, na UCSF, a moją dziedziną zainteresowań jest neurobiologia rozwoju. W szczególności bardzo interesują nas wczesne etapy rozwoju kory mózgowej; badamy komórki macierzyste i progenitorowe neuronów oraz analizujemy sposób, w jaki generują one neurony, a także to, jak neurony te migrują i zaczynają tworzyć obwody w rozwijającym się mózgu, zwłaszcza w korze.Sądzę, że wprowadzenie elektroporacji in utero było jedną z tych przełomowych technologii opracowanych przez SDO i jego współpracowników w kontekście badania wczesnych etapów rozwoju mózgu, ponieważ pozwala ona na przeprowadzanie eksperymentów z uzyskaniem i utratą funkcji dla szerokiej gamy genów. Można to robić w stosunkowo prosty sposób, wprowadzając te geny bezpośrednio do neuronalnych komórek macierzystych i progenitorowych, z których powstają neurony podczas wczesnego rozwoju kory mózgowej. Technika ta polega po prostu na wstrzyknięciu DNA w formie plazmidu do komór mózgu zwierzęcia w stadium embrionalnym, a następnie przyłożeniu krótkiego impulsu elektrycznego, który wprowadza plazmidy do komórek wyściełających komorę, czyli komórek glejowych radialnych i neuroepitelialnych, które następnie wytwarzają neurony, a ostatecznie komórki glejowe.Może to obejmować zastosowanie krótkich interferujących RNA, które mogą obniżać lub wyciszać ekspresję konkretnych genów, lub bezpośrednią nadekspresję wybranych produktów genowych. Oba te zestawy eksperymentów pozwalają badać komplementarne efekty w rozwijającym się mózgu. Cząsteczki docelowe mogą obejmować niemal wszystko, co bierze udział we wczesnych etapach rozwoju mózgu, a nawet w późniejszych fazach rozwoju lub dojrzewania synaptycznego.Wprowadzenie tej techniki już teraz wywarło znaczący wpływ na badania nad rozwijającym się mózgiem i zapowiada jeszcze większy wpływ w najbliższej przyszłości. Komórki wyścielające komorę, które ostatecznie tworzą wszystkie neurony oraz komórki glejalne w mózgu, zaczynają jako komórki neuroepithelialne. Jednak mniej więcej w czasie, gdy neurony zaczynają się rozwijać, przekształcają się one lub zaczynają przekształcać w rodzaj komórki glejowej znany jako komórka glejowa promieniście ułożona.Tworzą one wyspecjalizowane połączenia z naczyniami krwionośnymi i prowadzą migrację młodych neuronów. W tym samym czasie zaczynają przechodzić interesujący zestaw różnych typów podziałów. Wykonują rodzaj symetrycznego podziału progenitorów, w wyniku którego powstają kolejne kopie tych samych komórek, co oznacza, że przy każdym podziale powstają dwie komórki glei radialnej.Przeprowadzają one również asymetryczne podziały neurogenne, podczas których dzielą się i odnawiają, generując w każdym cyklu komórkowym komórkę potomną, która staje się neuronem. Okazuje się jednak, że wykonują one również bardzo interesujący trzeci typ podziału, który jest asymetryczny w tym sensie, że komórki potomne są różne. Jedna z nich jest odnowioną komórką glejową radialną, a druga staje się innym rodzajem komórki progenitorowej.Nazywamy je pośrednimi progenitorami, które migrują z komory, a następnie dzielą się zazwyczaj w innej strefie proliferacyjnej, znanej jako strefa podkomorowa. Metoda elektroporacji in utero jest wygodnym sposobem wprowadzania tych DNA do wyciszenia lub nadekspresji do komórek glejowych radialnych podczas etapów, w których dokonują one tych różnych rodzajów podziałów. Używamy również retrowirusa wykazującego białko fluorescencyjne GFP jako markera linii komórkowej, wstrzykując ten marker retrowirusowy do komór w tych samych przedziałach wiekowych, a następnie możemy śledzić losy tych indywidualnie oznakowanych komórek, gdy się one dzielą i generują klony komórek potomnych.Dzięki obrazowaniu w odstępach czasu (time-lapse), które przeprowadzamy na kulturach plastrów, możemy śledzić ostateczny los tych komórek podczas ich migracji do kory. Przez pewien czas uważano, że strefa komorowa jest głównym źródłem neurogenezy w rozwijającym się mózgu, jednak w przypadku zarodka coraz bardziej docenia się rolę strefy podkomorowej jako źródła znacznej ilości neurogenezy. Odkryliśmy, że w strefie podkomorowej pośrednie komórki progenitorowe, które same wywodzą się z glejoradykalnych komórek strefy komorowej, migrują tam i dzielą się symetrycznie – albo w celu wytworzenia kolejnych komórek progenitorowych poprzez samoodnowienie, albo w symetrycznym podziale terminalnym, aby wytworzyć pary neuronów, które następnie migrują do kory.Okazuje się zatem, że strefa podkomorowa jest bardzo ważnym i interesującym obszarem neurogenezy w mózgu zarodkowym lub rozwijającym się. Ponadto te pośrednie komórki progenitorowe, podczas przebywania w strefie podkomorowej, stają się komórkami wielobiegunowymi i wydają się posiadać zdolność do przemieszczania się stycznie w obrębie tej strefy. Może to wyjaśniać rozproszenie klonów komórkowych zaobserwowane w poprzednich badaniach, na przykład przeprowadzonych jakiś czas temu przez Walsh i S. Cepko w rozwijającej się korze mózgowej, w których również wykorzystano retrowirusy do znakowania losów tych komórek.Przykładowo, istnieje szereg interesujących genów, które, jak się okazuje, biorą udział w neurogenezie lub migracji neuronalnej. W naszym laboratorium badaliśmy białka połączeń szczelinowych, czyli połączenia stanowiące podstawę tworzenia znanych kanałów połączeń szczelinowych. Co ciekawe, odkryliśmy, że komórki migrujące wzdłuż glejowych włókien radialnych wykorzystują te połączenia szczelinowe nie jako kanały komunikacyjne, lecz jako cząsteczki adhezyjne, które fizycznie umożliwiają tym neuronom i migrującym komórkom przyleganie do włókien radialnych.Badania te zostały przeprowadzone z wykorzystaniem siRNA, które wyciszały ekspresję specyficznych połączeń. Przykładowo, połączenie 43, które wykazuje bardzo wysoką ekspresję w komórkach radial glia, a także w ich neuronach potomnych oraz pośrednich komórkach progenitorowych. Wiele tak zwanych dorosłych komórek macierzystych pochodzących z mózgu płodowego to w rzeczywistości prawdopodobnie komórki radial glia, które można namnażać w kulturze po zastosowaniu odpowiednich czynników wzrostu, takich jak na przykład bFGF.Jednak poza wspomnianą gleją radialną, progenitorzy pośredni mogą okazać się bardzo interesującym celem w badaniach nad komórkami macierzystymi, ponieważ uważamy, że produkują oni neurony o bardzo ograniczonym typie komórkowym. Zatem jeśli strategia zakładałaby na przykład stworzenie dużej liczby bardzo specyficznego typu komórek neuronalnych, możliwość zidentyfikowania i wyizolowania komórek progenitorów pośrednich odpowiedzialnych za generowanie tego konkretnego typu komórek byłaby prawdopodobnie znacznie lepszym podejściem niż na przykład namnażanie glei radialnej, która mogłaby wytworzyć całą gamę różnych typów komórek. W rzeczywistości w badaniach przeprowadzonych in vitro, podczas namnażania linii embrionalnych komórek macierzystych i późniejszego generowania z nich pojedynczych neuronów, wydaje się, że większość tych linii przechodzi przez etap, który może być wręcz obligatoryjny, o charakterze nabłonkowym lub podobnym do glei radialnej, zanim faktycznie powstaną neurony.W związku z tym, na przykład protokoły stosowane przez Austina Smitha do generowania neuronów lub neuralnych komórek macierzystych są w rzeczywistości bardzo podobne do komórek radialnej gleby. Wykazują one kinetyczną migrację jądra, wykazują ekspresję czynników transkrypcyjnych i markerów charakterystycznych dla gleby radialnej oraz generują neurony i astrocyty w sposób bardzo zbliżony do tego, jak robią to komórki radialnej gleby.Podobnie Loren Ser i inni wykorzystali ludzkie embrionalne komórki macierzyste i stwierdzili, że tworzą one rozetki, czyli w pewnym sensie samoorganizują się w strukturę typu neuroepithelialnego in vitro przed faktycznym wygenerowaniem neuronów. I ponownie, rozetki te składają się z komórek, które bardzo przypominają glię radialną. Myślę więc, że teza, wedle której komórki glii radialnej są rodzajem neuralnych komórek macierzystych, znajduje potwierdzenie w tego rodzaju dowodach in vitro.Zatem przed rozpoczęciem neurogenezy w całej strefie komorowej wszystkich komór, a w rzeczywistości wzdłuż całego rdzenia kręgowego, zachodzi już regionalizacja. Geny odpowiedzialne za tę regionalizację, których ekspresja występuje w konkretnych obszarach, prawdopodobnie już ograniczają losy powstających tam komórek potomnych. Przykładowo, jeśli chcielibyśmy uzyskać pobudzające komórki piramidalne, typ ten wytwarzają grzbietowe korowe komórki glejopromieniiste; natomiast w celu otrzymania interneuronów należałoby wykorzystać komórki z wyniosłości zwojowej, ponieważ to one produkują interneurony, lub oligodendrocyte i tak dalej.Zatem jeśli strategia w badaniach nad komórkami macierzystymi w kontekście leczenia choroby polega na stworzeniu dużej liczby komórek konkretnego typu, np. określonego rodzaju neuronów interneuronów lub określonego rodzaju pobudzających komórek projekcyjnych, to badania rozwojowe, które zaczynają ujawniać różnice w neurogenezie pomiędzy tymi odrębnymi obszarami mózgu, prawdopodobnie dostarczą wskazówek, które ostatecznie okażą się użyteczne w projektowaniu strategii namnażania neuronów danego typu komórkowego, na przykład w celu zastosowania w terapiach komórkami zastępczymi. Terminologia dotycząca regeneracji lub medycyny regeneracyjnej sugeruje w istocie zdolność do regeneracji narządów. Myślę, że większość opinii publicznej postrzega komórki macierzyste jako metodę zastępowania komórek w uszkodzonych tkankach.W rzeczywistości uważam jednak, że pierwsze terapie, które prawdopodobnie wyłonią się z badań nad komórkami macierzystymi, będą polegać na wykorzystaniu tych komórek w inny, być może bardziej kreatywny sposób. Przykładem może być wykorzystanie badań nad komórkami macierzystymi w laboratorium, co pozwala na przesiewowe badanie leków za pomocą metod wysokoprzepustowych, modelując choroby przy użyciu ludzkich komórek zamiast, na przykład, komórek mysich. Z kolei w kwestii terapii komórkowych uważam, że w dużej mierze – a w zasadzie sądzę, że już zaczęto je stosować – będą one służyć jako nośniki. Można na przykład wykorzystać zdolność niektórych komórek macierzystych do migracji w obszary urazu lub choroby, aby dostarczyć ładunek, taki jak gen, produkt genu, brakujący enzym i tym podobne.Sądzę, że zastosowanie, które nie wymaga integrowania się komórek z istniejącymi strukturami narządów, jest łatwiejsze do osiągnięcia. Możliwe, że niektóre z wczesniejszych przykładów terapii komórkowych będą opierać się na takim podejściu, a nie na faktycznym zastąpieniu komórek. Tymczasem obecne federalne ograniczenia dotyczące wykorzystania funduszy NIH w odniesieniu do niewielkiej liczby ludzkich embrionalnych komórek macierzystych wywarły naprawdę hamujący wpływ na tę dziedzinę.Zniechęciło to niektórych młodych badaczy do pracy w tej dziedzinie i powstrzymało innych przed rzeczywistym zbadaniem potencjalnej użyteczności tych embrionalnych komórek macierzystych w laboratorium. Podejmowano próby liberalizacji tych ograniczeń. Jak prawdopodobnie wie większość Państwa, prezydent zawetował jeden projekt ustawy i prawdopodobnie, przepraszam, zamierza zawetować kolejny.Mamy nadzieję, że zasady te ulegną zmianie i możliwe stanie się wykorzystanie funduszy NIH do badania całego szeregu nowo opracowanych linii komórek macierzystych, z których wiele posiada przewagę nad tymi pierwotnymi, stworzonymi przed 2001 rokiem. Jednak nawet jeśli zakaz finansowania zostanie zniesiony, prawdopodobnie nie przełoży się to natychmiast na wzrost funduszy na tego typu badania. Ponieważ jednak projekt ustawy, który został na przykład zaproponowany w Kongresie, nie jest ustawą budżetową ani przeznaczającą środki, będzie on miał wpływ na ułatwienie badaczom takim jak my łączenia prac z tak zwanymi liniami zatwierdzonymi i niezatwierdzonymi w tej samej przestrzeni badawczej, w tym samym laboratorium, przy użyciu tego samego sprzętu lub współdzieleniu niektórych tych samych zasobów.Wszystko to stanowiłoby ogromną poprawę, lecz mało prawdopodobne jest, aby zaowocowało to dużym napływem rzeczywistego wsparcia w postaci funduszy badawczych na tego rodzaju działania. Sądzę, że w tej kwestii wciąż będziemy musieli polegać na źródłach prywatnych, w tym na funduszach stanowych, które tutaj, w Kalifornii, są prawdziwym błogosławieństwem dla badaczy w dziedzinie komórek macierzystych. Oprócz Kalifornii inne stany, takie jak Nowy Jork, Connecticut i Massachusetts, postępują w ten sam sposób i wkrótce będą finansować własne inicjatywy stanowe na rzecz badań nad komórkami macierzystymi.Sądzę, że będzie to istotny motor napędowy badań w tej dziedzinie w dającej się przewidzieć przyszłości, niezależnie od tego, czy polityka NIH ulegnie wkrótce zmianie, czy nie.

cortical-neurogenesis-transitioning-from-advances-laboratory-to-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neurogeneza korowa: przejście od postępów w laboratorium do terapii komórkowych

University of California, San Francisco - UCSF.  Neurogeneza korowa: przejście od postępów w laboratorium do terapii komórkowych

Neurogeneza korowa: przejście od osiągnięć laboratoryjnych do terapii komórkowych

W tym artykule

Oświadczenia

Przedruki i uprawnienia

Tagi