Wzorce mikroprzepływowe i śledzenie wzrostu bakterii jednokomórkowych na podstawie fluorescencji

Streszczenie

Źródło: Pioli, R., et al., Modeling of microorganisms and microparticles through Sequential Capillarity-assisted Assembly. J. Vis. Exp. (2021)

Ten film pokazuje metodę wychwytywania pojedynczych, znakowanych fluorescencyjnie komórek Escherichia coli (E. coli) w pułapkach mikroprzepływowych przy użyciu bezwęglowej zawiesiny i kontrolowanego przepływu, a następnie dodawania składników odżywczych w celu wyzwalania wzrostu i obrazowania fluorescencyjnego mikrokolonii.

Protokół

1. Wzorce bakteryjne

1. Na dzień przed eksperymentem należy wyhodować populację Escherichia coli (szczep MG1655 prpsM-GFP). Zaszczepić kulturę bezpośrednio z zamrożonego bulionu i rosnąć przez noc przez 20 godzin w pożywce bulionu lizogenicznego (LB) w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37 °C. Dodać 50 μg/ml kanamycyny, aby komórki zachowały plazmid prpsM-GFP (zielone białko fluorescencyjne).
2. W dniu doświadczenia należy ustawić inkubator skrzynkowy (rysunek 1A) na 37 °C na kilka godzin przed rozpoczęciem eksperymentu, aby zapewnić jednolitą i stabilną temperaturę. Następnie ustaw pompę strzykawkową i podgrzewaną szklaną płytkę na stoliku mikroskopu (rysunek 1B,C), ustawiając temperaturę na tę samą temperaturę, co inkubator pudełkowy.
   NUTA: Inkubator skrzynkowy, w którym zamknięty jest cały system, w tym mikroskop (rysunek 1E), zapewnia utrzymanie jednolitej i stałej temperatury przez cały czas trwania eksperymentu, gdy kanał jest przepłukiwany pożywką.
3. Dziewięćdziesiąt minut przed eksperymentem umieść chip mikroprzepływowy w naczyniu wypełnionym 100% etanolem (EtOH) i przepłukuj kanał 100% EtOH przez co najmniej 10 minut. Umieścić chip mikroprzepływowy w eksykatorze próżniowym i odgazowywać przez co najmniej 30 minut. Wymień EtOH na wodę destylowaną i poddaj chip obróbce próżniowej przez co najmniej 30 minut. Włóż chip mikroprzepływowy do piekarnika w temperaturze 70 °C na 10 minut, aby usunąć wszelkie ślady płynu pozostawionego w kanale.
   NUTA: Ten krok jest niezbędny, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków w kanale po przepłukaniu pożywką hodowlaną.
4. Odpipetować 1 ml pożywki z kwasem 3-(N-morfolino)propanosulfonowym (MOPS) (1x) do fiolki wirówkowej i dodać 10 μl 0,132 M fosforanu potasu (_K2HPO₄). Wyjąć całonocną kulturę z inkubatora w temperaturze 37 °C i podać podwielokrotność 100 μl do fiolki wirówkowej i odwirować kulturę w temperaturze 2 300 × g przez 2 minuty. Delikatnie odpipetować supernatant z fiolek wirówek i ponownie zawiesić osad w 1 ml świeżej pożywki MOPS z 0,015% v/v Tween 20 i 0,01% v/v fosforanu potasu.
   NUTA: Typowe stężenie zawiesiny bakteryjnej mieści się w zakresie 0,015-0,15 obj., co zapewnia powstanie rozszerzonej i ruchomej strefy akumulacji oraz zapobiega gromadzeniu się cząstek na podłożu. Zastąpienie pożywki na noc pożywką świeżą minimalizuje ryzyko uwolnienia się warstw bakterii na szablonie. Brak źródła węgla w świeżej pożywce zapobiega wzrostowi komórek w zawiesinie podczas tworzenia wzoru matrycowego. Stężenie 0,015% v/v Tween 20 w zawiesinie jest konieczne, aby kąt zwilżania cofającej się cieczy na matrycy PDMS mieścił się w optymalnym zakresie, od 30 do 60°.
5. Załadować zawiesinę bakteryjną do strzykawki o pojemności 1 ml i podłączyć strzykawkę do chipa za pomocą rurki mikroprzepływowej.
   1. Aby zabezpieczyć połączenie między strzykawką a rurką, należy bezpośrednio wprowadzić igłę o średnicy zewnętrznej 0,6 mm do rurki. Aby uniknąć rozsypania zawiesiny pozostałej w pobliżu wlotu w poprzek kanału, należy przepłukać świeże medium przez otwór używany jako wylot podczas procesu tworzenia wzoru (Rysunek 2A-III), a nie przez otwór używany jako wlot.
   2. Zamontować strzykawkę na pompie strzykawkowej i wstrzyknąć zawiesinę do chipa mikroprzepływowego przez wlot znajdujący się w górnej części kanału, aż zawiesina pokryje obszar szablonu pułapkami. NUTA: Podczas procesu wtryskiwania cieczy powietrze może wydostawać się przez wylot znajdujący się na dolnym końcu kanału.
   3. Ustawić pompę strzykawkową tak, aby pobierała zawiesinę bakteryjną (rysunek 2A-I) przy natężeniu przepływu 0,07-0,2 μl/min, co w opisanej geometrii odpowiada prędkości cofania menisku wynoszącej 80-100 μm/min.
   4. Monitoruj proces tworzenia wzorów za pomocą oprogramowania mikroskopowego.
      NUTA: W tym przypadku zastosowano 10-krotne powiększenie do monitorowania cofającej się łąkotki na szablonie, a 20-krotne powiększenie użyto do monitorowania osadzania się poszczególnych bakterii w mikrofabrykowanych pułapkach.
6. Po ułożeniu matrycy za pomocą komórek (rysunek 2A-II) zwiększ natężenie przepływu pobierania, aby szybko opróżnić kanał mikroprzepływowy i przepłukać go świeżym LB, który był wcześniej odgazowywany przez co najmniej 30 minut i wstępnie podgrzany w temperaturze 30 °C.
7. Ustaw pompę strzykawkową na natężenie przepływu 2 μl/min, aby delikatnie przepłukać kanał. Po napełnieniu kanału należy zwiększyć natężenie przepływu (15 μl/min) zgodnie z konkretnymi potrzebami eksperymentalnymi.
8. Uzyskuj obrazy rosnących bakterii w żądanym powiększeniu i odstępie czasu.

Wyniki

Rysunek 1: Schemat platformy do sekwencyjnego montażu kapilarnego wspomaganego kapilarnie w kanale mikroprzepływowym. (A) Inkubator pudełkowy. Inkubator skrzynkowy utrzymuje jednolitą i stałą temperaturę (w tym przypadku 30 °C) wewnątrz kana...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Strzykawka BD 10 ml (Luer-Lock)	BD	300912	Służy do wypłukiwania świeżego bulionu lizogennego do kanału mikroprzepływowego
Inkubator skrzynkowy	Usługi obrazowania życia		Służy do zapewnienia jednolitej i stałej temperatury w kanale
Wirówka	Eppendorf powiedział:	5424R	Służy do zastępowania pożywki nocnej świeżą minimalną ilością pożywki
Fiolka wirówkowa	Eppendorf powiedział:	30120086	1,5 ml
CETONI Baza 120	CETONI GmbH		Pompa strzykawkowa
KONTROLER H401-T	Okolab		Sterownik podgrzewanej płyty szklanej
H601-NIKON-TS2R-SZKŁO	Okolab		Podgrzewana szklana płyta
Strzykawki insulinowe U 100 z luer	Codan Medical ApS	CODA621640	Strzykawka 1 ml używana do pobierania płynnej zawiesiny podczas procesu modelowania
LB bulion, młynarz (Luria-Bertani)	Fisher Naukowy	244610	Rosół lizogeniczny spłukiwany do kanału mikroprzepływowego
Rurki przesyłowe Masterflex	Technologia Masterflex	HV-06419-05	0,020 '' ID, 0,06'' OD
MOPS (10x)	Teknova	Zobacz materiał M2101	Rozcieńczony dziesięciokrotnie wodą miliQ i stosowany w celu zastąpienia pożywki na noc
Nikon Eclipse Ti2	Instrumenty firmy Nikon		Mikroskop
Fosforan potasu dwuzasadowy	Sigma Aldrich	Zobacz materiał P3786	Dodano do MOPS 1x
Animacja 20	Sigma Aldrich	Zobacz materiał P1379 powiedział:	Służy do zapewnienia optymalnego kąta zwilżania podczas procesu modelowania