Ten film pokazuje wykorzystanie genetycznie zmodyfikowanych bioczujników bakteryjnych do dokładnego pomiaru biodostępnej frakcji jonów rtęci w warunkach beztlenowych. Zmieniając stężenie siarczanu magnezu, test zapewnia, że bioczujnik selektywnie reaguje na wolne jony rtęci, na co wskazują zmiany intensywności fluorescencji.
Projektowanie układu płyt. NUTA: Należy upewnić się, że wszystkie wartości pipetowania zostały obliczone, a zapasy przygotowane przed rozpoczęciem badania narażenia. Szczegółowe informacje na temat tego, jak prawidłowo zaprojektować eksperyment i jakie elementy sterujące należy uwzględnić, opisano w tekście. Ponadto eksperymentu nie należy rozpoczynać, jeśli w komorze beztlenowej wskazanej na monitorze beztlenowym znajduje się tlen.
Zaprojektuj układ płytki zgodnie z szablonem 96-dołkowym. Pozwoli to na przeprowadzenie eksperymentów przy użyciu 32 różnych metod leczenia w technicznych powtórzeniach 3, które najlepiej reprezentują siatka 4 x 8 do ustawiania fiolek (patrz rysunek 1).
NUTA: Podczas badania roli zmiennej w wychwytywaniu Hg za pomocą biosensora indukowanego rtęcią, dla każdej zmiennej wymagane są dwa zabiegi: zabieg (bioczujnik + rtęć (Hg) + zmienna + azotan) i ślepa próba leczenia (bioczujnik + zmienna + azotan). Podczas badania roli zmiennej w fizjologii komórki za pomocą biosensora konstytutywnego, wymagane są dwa zabiegi dla każdej zmiennej: leczenie (bioczujnik + Hg + zmienna + azotany) i ślepa próba leczenia(bioczujnik + zmienna + Hg). Rtęć można zastąpić kadmem (Cd). Hg lub Cd staną się zmienną podczas wykonywania krzywej kalibracyjnej. Biosensory konstytutywne i indukowalne nie muszą być uruchamiane w tym samym czasie (w tym samym układzie płytek). Przykładowy wzór układu płytek i odpowiadającej mu siatki 4 x 8 podczas badania zakresu stężeń magnezu (zmiennego) znajduje się w tabeli 1.
2. Ustaw siatkę 4 x 8 zgodnie z układem płytki testowej.
1. Umieścić standardowe fiolki z politetrafluoroetylenu (PTFE) o pojemności 7 ml na tacy. NUTA: Fiolki z PTFE należy przed użyciem umyć kwasem lub wysterylizować termicznie. Należy się z nimi obchodzić wyłącznie poprzez manipulowanie zewnętrzną stroną fiolki.
2. Do każdej fiolki dodać objętość podłoża ekspozycyjnego odpowiadającą każdemu zabiegowi. NUTA: W przypadku ekspozycji o całkowitej objętości 2 000 μl (2 ml) dodane podłoże ekspozycyjne będzie wynosiło: podłoże ekspozycyjne μL = 2 000 μL – leczenie (ślepa próba) μL. (np. podłoże ekspozycyjne μL = 2 000 – 100 μL (biosensor) – 40 μL (azotan) – 100 μL (Hg) – 100 μL (zmienne (np. siarczan magnezu,MgSO4)) = 1660 μL). Należy upewnić się, że objętość dodanej badanej zmiennej nie przekracza 5% (100 μL) objętości końcowej.
3. Dodać odpowiednią objętość roztworu badanej zmiennej chemicznej do każdej fiolki, zgodnie z układem płytek.
4. Dodać azotan do każdej fiolki tak, aby końcowe stężenie wynosiło 200 μM (40-80 μL). Wyklucz ten krok w przypadku konstytutywnych ślepych prób leczenia biosensorami.
5. Dodać Hg (5 nM w przypadku badania na obecność zmiennej) lub Cd (300 nM w przypadku badania na obecność zmiennej) do fiolek zgodnie z układem płytki. Należy wykluczyć ten etap w przypadku ślepych prób biosensorów inwazyjnych rtęcią.
1. Używając Hg, weź bulion 4-8 μM i dobrze wstrząśnij. Rozcieńczyć roztwór w pożywce ekspozycyjnej w fiolce z 7 ml PTFE do 100-250 nM , aby uzyskać działający roztwór Hg. Z tego roztworu roboczego dodać Hg do wymaganych fiolek. W tym przypadku krzywa kalibracyjna Hg w zakresie od 0 do 12,5 nM. NUTA: Badając wpływ zmiennej na biodostępność Hg lub Cd, upewnij się, że [Hg] lub [Cd] pozostają stałe we wszystkich zabiegach. Podczas dodawania Hg lub Cd należy używać jednej końcówki pipety, ale nigdy nie dotykać podłoża ekspozycyjnego w fiolkach.
Potrząśnij ruchem orbitalnym ręcznie. NUTA: Eksperyment można teraz wstrzymać, w zależności od czasu wymaganego do specjacji Hg lub Cd w roztworze. W przypadku pozostawienia na dłużej niż godzinę należy umieścić nakrętki z PTFE na fiolkach z PTFE, aby zapobiec parowaniu/zanieczyszczeniu.
Delikatnie pipetuj zapasy Biosensora tam i z powrotem, aby zapewnić jednorodność. Dodać 100 μl Biosensor Stock do każdej fiolki. Potrząśnij orbitalnie ręcznie.
Przygotuj czytnik płytek do rozgrzania do odczytu z następującymi kryteriami: Temperatura 37°C, bieg kinetyczny przez 10 godzin z odczytami co 2,5-5 minut z wytrząsaniem orbitalnym pomiędzy odczytami oraz pomiary fluorescencji ze wzbudzeniem fluorescencji 440 nm i emisją 500 nm.
Odpipetować 200 μl z każdej fiolki z PTFE w siatce 4 x 8 do odpowiednich dołków płytki 96-dołkowej (czarne, 96-dołkowe mikropłytki z przezroczystym dnem). Pipetę należy pipetować tam i z powrotem pięć razy przed przeniesieniem każdych 200 μl.UWAGA: Zamiast wyrzucać końcówkę pipety, pozostaw końcówkę pipety w fiolce z PTFE, aby śledzić postęp pipetowania.
Umieść 96-dołkową płytkę w tacce czytnika płytek, a następnie umieść pokrywkę na 96-dołkowej płytce i rozpocznij test.
Tabela 1: Przykładowy układ płytek do wykorzystania biosensora do badania biodostępności Hg (5 nM) na gradiencie magnezu (0-10 mM)