Test biosensora bakteryjnego do wykrywania biodostępnej rtęci w warunkach beztlenowych

Streszczenie

Źródło: Stenzler, B. R. i wsp., Beztlenowy test biosensoryczny do wykrywania rtęci i kadmu. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film pokazuje wykorzystanie genetycznie zmodyfikowanych bioczujników bakteryjnych do dokładnego pomiaru biodostępnej frakcji jonów rtęci w warunkach beztlenowych. Zmieniając stężenie siarczanu magnezu, test zapewnia, że bioczujnik selektywnie reaguje na wolne jony rtęci, na co wskazują zmiany intensywności fluorescencji.

Protokół

1. Test narażenia

1. Projektowanie układu płyt.
   NUTA: Należy upewnić się, że wszystkie wartości pipetowania zostały obliczone, a zapasy przygotowane przed rozpoczęciem badania narażenia. Szczegółowe informacje na temat tego, jak prawidłowo zaprojektować eksperyment i jakie elementy sterujące należy uwzględnić, opisano w tekście. Ponadto eksperymentu nie należy rozpoczynać, jeśli w komorze beztlenowej wskazanej na monitorze beztlenowym znajduje się tlen.
2. Zaprojektuj układ płytki zgodnie z szablonem 96-dołkowym. Pozwoli to na przeprowadzenie eksperymentów przy użyciu 32 różnych metod leczenia w technicznych powtórzeniach 3, które najlepiej reprezentują siatka 4 x 8 do ustawiania fiolek (patrz rysunek 1).

NUTA: Podczas badania roli zmiennej w wychwytywaniu Hg za pomocą biosensora indukowanego rtęcią, dla każdej zmiennej wymagane są dwa zabiegi: zabieg (bioczujnik + rtęć (Hg) + zmienna + azotan) i ślepa próba leczenia (bioczujnik + zmienna + azotan). Podczas badania roli zmiennej w fizjologii komórki za pomocą biosensora konstytutywnego, wymagane są dwa zabiegi dla każdej zmiennej: leczenie (bioczujnik + Hg + zmienna + azotany) i ślepa próba leczenia (bioczujnik + zmienna + Hg). Rtęć można zastąpić kadmem (Cd). Hg lub Cd staną się zmienną podczas wykonywania krzywej kalibracyjnej. Biosensory konstytutywne i indukowalne nie muszą być uruchamiane w tym samym czasie (w tym samym układzie płytek). Przykładowy wzór układu płytek i odpowiadającej mu siatki 4 x 8 podczas badania zakresu stężeń magnezu (zmiennego) znajduje się w tabeli 1.

2. Ustaw siatkę 4 x 8 zgodnie z układem płytki testowej.

1. Umieścić standardowe fiolki z politetrafluoroetylenu (PTFE) o pojemności 7 ml na tacy.
NUTA: Fiolki z PTFE należy przed użyciem umyć kwasem lub wysterylizować termicznie. Należy się z nimi obchodzić wyłącznie poprzez manipulowanie zewnętrzną stroną fiolki.

2. Do każdej fiolki dodać objętość podłoża ekspozycyjnego odpowiadającą każdemu zabiegowi.
NUTA: W przypadku ekspozycji o całkowitej objętości 2 000 μl (2 ml) dodane podłoże ekspozycyjne będzie wynosiło: podłoże ekspozycyjne μL = 2 000 μL – leczenie (ślepa próba) μL. (np. podłoże ekspozycyjne μL = 2 000 – 100 μL (biosensor) – 40 μL (azotan) – 100 μL (Hg) – 100 μL (zmienne (np. siarczan magnezu, MgSO₄)) = 1660 μL). Należy upewnić się, że objętość dodanej badanej zmiennej nie przekracza 5% (100 μL) objętości końcowej.

3. Dodać odpowiednią objętość roztworu badanej zmiennej chemicznej do każdej fiolki, zgodnie z układem płytek.

4. Dodać azotan do każdej fiolki tak, aby końcowe stężenie wynosiło 200 μM (40-80 μL). Wyklucz ten krok w przypadku konstytutywnych ślepych prób leczenia biosensorami.

5. Dodać Hg (5 nM w przypadku badania na obecność zmiennej) lub Cd (300 nM w przypadku badania na obecność zmiennej) do fiolek zgodnie z układem płytki. Należy wykluczyć ten etap w przypadku ślepych prób biosensorów inwazyjnych rtęcią.

1. Używając Hg, weź bulion 4-8 μM i dobrze wstrząśnij. Rozcieńczyć roztwór w pożywce ekspozycyjnej w fiolce z 7 ml PTFE do 100-250 nM , aby uzyskać działający roztwór Hg. Z tego roztworu roboczego dodać Hg do wymaganych fiolek. W tym przypadku krzywa kalibracyjna Hg w zakresie od 0 do 12,5 nM.
NUTA: Badając wpływ zmiennej na biodostępność Hg lub Cd, upewnij się, że [Hg] lub [Cd] pozostają stałe we wszystkich zabiegach. Podczas dodawania Hg lub Cd należy używać jednej końcówki pipety, ale nigdy nie dotykać podłoża ekspozycyjnego w fiolkach.

Potrząśnij ruchem orbitalnym ręcznie.
NUTA: Eksperyment można teraz wstrzymać, w zależności od czasu wymaganego do specjacji Hg lub Cd w roztworze. W przypadku pozostawienia na dłużej niż godzinę należy umieścić nakrętki z PTFE na fiolkach z PTFE, aby zapobiec parowaniu/zanieczyszczeniu.

Delikatnie pipetuj zapasy Biosensora tam i z powrotem, aby zapewnić jednorodność. Dodać 100 μl Biosensor Stock do każdej fiolki. Potrząśnij orbitalnie ręcznie.

Przygotuj czytnik płytek do rozgrzania do odczytu z następującymi kryteriami: Temperatura 37°C, bieg kinetyczny przez 10 godzin z odczytami co 2,5-5 minut z wytrząsaniem orbitalnym pomiędzy odczytami oraz pomiary fluorescencji ze wzbudzeniem fluorescencji 440 nm i emisją 500 nm.

Odpipetować 200 μl z każdej fiolki z PTFE w siatce 4 x 8 do odpowiednich dołków płytki 96-dołkowej (czarne, 96-dołkowe mikropłytki z przezroczystym dnem). Pipetę należy pipetować tam i z powrotem pięć razy przed przeniesieniem każdych 200 μl.UWAGA: Zamiast wyrzucać końcówkę pipety, pozostaw końcówkę pipety w fiolce z PTFE, aby śledzić postęp pipetowania.

Umieść 96-dołkową płytkę w tacce czytnika płytek, a następnie umieść pokrywkę na 96-dołkowej płytce i rozpocznij test.

 

Tabela 1: Przykładowy układ płytek do wykorzystania biosensora do badania biodostępności Hg (5 nM) na gradiencie magnezu (0-10 mM)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

a

Bioczujnik indukowany Hg + Hg + azotan + 0 mM Mg

Biosensor indukowany Hg + azotany + 0 mM Mg

Konstytutywny bioczujnik + Hg + azotany + 0 mM Mg

Bioczujnik konstytutywny + Hg + 0 mM Mg

b

Bioczujnik indukowany Hg + Hg + Azotan + 0,1 mM Mg

Biosensor indukowany Hg + azotan + 0,1 mM Mg

Konstytutywny biosensor+ Hg + Azotany + 0,1 mM Mg

Bioczujnik konstytutywny + Hg + 0,1 mM Mg

c

Biosensor indukowany Hg + Hg + azotan + 1 mM Mg

Bioczujnik indukowany Hg + azotany + 1 mM Mg

Konstytutywny bioczujnik + Hg + azotany + 1 mM Mg

Bioczujnik konstytutywny + Hg + 1 mM Mg

d

Biosensor indukowany Hg + Hg + Azotan + 10 mM Mg

Biosensor indukowany Hg + Azotany + 10 mM Mg

Konstytutywny bioczujnik + Hg + azotany + 10 mM Mg

Konstytutywny bioczujnik + Hg + 10 mM Mg

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fiolka standardowa o pojemności 7 ml, zaokrąglone wnętrze	Delta Scientific	200-007-20	34 zalecane
Tacka na fiolki, otwory 21 mm	Delta Scientific	730-2001	4 dla (siatka 4 x 8)
Zapięcie 24 mm	Delta Scientific	600-024-01	Zalecane: 32
Corning 96-dołkowa przezroczysta, niewiążąca mikropłytka powierzchniowa z przezroczystym dnem	Corning	Corning 3651 powiedział:
Komora beztlenowa (komora rękawicowa)			Powietrze w komorze beztlenowej powinno składać się z azotu (97 % ± 2 % i 3 % wodoru ± 2 %)
Czytnik mikropłytek
Filtr 450 (±10) nM do czytnika mikropłytek
Filtr 500 (±10) nM do czytnika mikropłytek