$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Odczynniki do przygotowania testu
- Przygotować roztwór cytrynianu arsenitu.
- Odważyć 5 g arsenianu sodu i 5 g dwuwodnego cytrynianu trisodowego.
OSTROŻNOŚĆ: Arsenin sodu jest toksyczny; Dlatego używaj odpowiedniego sprzętu ochronnego i obchodź się ze szczególnym traktowaniem. Ze względów ostrożności nie należy dotykać przed przeczytaniem i zrozumieniem wszystkich niezbędnych środków ostrożności. Przechowywać wyłącznie w dygestorium, aby nie wdychać pyłu/oparów związku lub jego roztworu(ów). W przypadku dostania się do dróg oddechowych wynieść się na świeże powietrze i uzyskać pomoc lekarską. Nosić odpowiednie okulary ochronne przed chemikaliami, rękawice ochronne i odzież, aby uniknąć połknięcia i kontaktu z oczami/skórą. W przypadku połknięcia należy natychmiast skontaktować się z ośrodkiem zatruć lub lekarzem. Jeśli dostanie się na skórę lub do oka (oczu), przemyj je dużą ilością wody i zasięgnij porady lekarza. - Rozpuścić w 100 ml wody.
- Dodaj 5 ml lodowatego kwasu octowego, wymieszaj i dodaj wodę do 250 ml.
- Przechowywać w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem.
NUTA: Rozwiązanie jest stabilne przez ponad rok.
- Przygotować roztwór A i roztwór B.
- Do roztworu A dodać 10 ml lodowatego 0,5 M HCl (kwasu solnego) do 0,3 g kwasu askorbinowego. Rozpuść kwas askorbinowy przez wirowanie.
- W przypadku roztworu B dodać 1 ml lodowatej wody do 70 mg tetrahydratu heptamolibdenianu amonu i odwirować do rozpuszczenia.
NUTA: Oba roztwory należy przechowywać na lodzie do czasu użycia. W celu zapewnienia spójności wyniku testu, oba roztwory można przechowywać na lodzie przez maksymalnie jeden tydzień.
- Przygotować wzorzec fosforanowy (Pi) o stężeniu 0 μM, 62,5 μM, 250 μM i 500 μM do kalibracji.
- Dodać 0 μl, 25 μl, 50 μl i 100 μl dwuwodnego 5 mM Na2HPO4 (fosforan disodowy) do czterech mikroprobówek zawierających 370 μl mieszaniny reakcyjnej.
- Uzupełnić wodą do 1 ml.
2. Test aktywności dla jednej płytki 96-dołkowej
NUTA: Patrz rysunek 1, aby zapoznać się ze schematycznym przebiegiem pracy testu.
- Dodać 1 ml roztworu B do 10 ml roztworu A, wymieszać przez wirowanie i przechowywać roztwór na lodzie.
NUTA: To rozwiązanie powinno być przezroczyste i żółte. Roztwór A + B należy przechowywać na lodzie przez co najmniej 30 minut przed użyciem. Należy jednak zużyć roztwór w ciągu 3 godzin, ponieważ po długotrwałym przechowywaniu ulegnie zepsuciu. - Dodać 40 μl wzorca 0 μM, 62,5 μM, 250 μM i 500 μM Pi do pasków probówek w trzech egzemplarzach za pomocą pipety wielokanałowej.
NUTA: Mieszanina reakcyjna bez dodatku liczby Pi zostanie użyta jako ślepa próba. - Dodać 25 μl roztworu złożonego do pasków probówek za pomocą pipety wielokanałowej.
NUTA: Każdy związek ma trzy różne stężenia w trzech powtórzeniach, co wystarcza do wstępnego oszacowania połowy maksymalnego stężenia hamującego (IC50). W celu dokładniejszego oznaczenia IC50 można zastosować osiem różnych stężeń związków. W przypadku niehamowanego enzymu roztwór związku zastępuje się równą ilością wody. Jako kontrolę pozytywną użyto 2,5 μM, 25 μM i 250 μM soli sodowej imidodifosforanu (IDP). - Dodać 15 μl mieszaniny roztworu mPPazy (pirofosfatazy związanej z błoną) do pasków probówek (z wyjątkiem probówek zawierających wzorzec Pi) za pomocą pipety wielokanałowej.
- Uszczelnij paski rur za pomocą samoprzylepnego arkusza uszczelniającego. Wytnij arkusz uszczelniający, aby oddzielić każdy pasek rury.
- Próbki należy wstępnie inkubować przez 5 minut w temperaturze 71 °C. Umieścić próbki w bloku grzewczym w odstępie 20 s między każdym paskiem, aby zminimalizować zużycie czasu podczas kolejnych etapów.
- Dla każdego paska otwórz uszczelkę samoprzylepną. Dodać 10 μl 2 mM dwuzasadowego pirofosforanu sodu za pomocą pipety wielokanałowej i mieszać, pipetując w górę i w dół przez 5×. Ponownie uszczelnij taśmę rurową za pomocą tego samego uszczelnienia.
NUTA: Ten krok może być początkowo trudny do wykonania w ciągu 20 sekund; Jednak po kilku testach stanie się to łatwiejsze. - Inkubować w temperaturze 71 °C przez 5 minut.
- Umieścić próbki w aparacie chłodzącym w odstępie 20 s między każdym paskiem. Pozwól im ostygnąć przez 10 minut, ale odwiruj każdy pasek na krótko po 5 minutach chłodzenia, aby zdekantować krople wody pod arkuszem uszczelniającym, a następnie włóż go z powrotem do aparatu chłodzącego i usuń uszczelkę.
NUTA: Aparat chłodzący można po prostu wykonać, umieszczając 96-dołkową płytkę do PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy) na polistyrenowej szalce Petriego (rozmiar 150 mm × 15 mm) wypełnionej wodą i zamrożonej na co najmniej 1 godzinę. Aparat należy wyjąć z zamrażarki na około 5 minut przed rozpoczęciem testu. Nie należy wyjmować aparatu chłodzącego bezpośrednio przed schłodzeniem próbki, ponieważ spowoduje to zamrożenie mieszaniny reakcyjnej i utrudni rozwój koloru. - Po 10 minutach schładzania dodać 60 μl roztworu A + B, mieszać pipetując w górę i w dół przez 5× i trzymać paski probówek na aparacie chłodzącym przez 10 minut.
- Dodać 90 μl roztworu cytrynianu arsenitu i przechowywać w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut, aby uzyskać stabilny niebieski kolor.
OSTROŻNOŚĆ: Ze względu na jego toksyczność, ze wszystkimi roztworami zawierającymi arsenian sodu należy obchodzić się ze szczególną ostrożnością przez cały czas. Dlatego dodawanie roztworu cytrynianu arsenitu powinno odbywać się w dygestorium. - Dozować 180 μl każdej mieszaniny reakcyjnej do przezroczystej 96-dołkowej mikropłytki polistyrenowej.
- Zmierzyć absorbancję każdej studzienki przy długości fali 860 nm za pomocą spektrofotometru z mikropłytkami.
