Wizualizacja białek kiełkujących w błonie wewnętrznej zarodników bakterii

Streszczenie

Źródło: Wen, J., Pasman, et al., Wizualizacja germinosomów i błony wewnętrznej w zarodnikach Bacillus subtilis . J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii oświetlenia strukturalnego do uzyskania trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych, które ujawniają organizację białek kiełkujących w zarodnikach bakterii.

Protokół

1. Obrazowanie białka kiełkującego (czas: 1 godzina)
   1. Uchwyć obrazy transmisyjne i fluorescencyjne zarodników, a także mieszaniny czerwonych i żółto-zielonych mikrosfer fluorescencyjnych modyfikowanych karboksylanem na mikroskopie oświetlenia strukturalnego (patrz tabela materiałów) wyposażonym w 100-krotny obiektyw olejowy (apertura numeryczna = 1,49), kamerę CCD (urządzenie sprzężone z ładunkiem) i oprogramowanie do analizy obrazu (patrz tabela materiałów). Generuj wszystkie obrazy w temperaturze pokojowej bez zakłóceń światła otoczenia. Upewnij się, że zawsze czyścisz obiektyw 100x i szkiełko 75% etanolem przed obrazowaniem.
   2. Skoncentruj się na mikrosferach fluorescencyjnych o średnicy 100 nm i zoptymalizuj funkcję rozproszenia punktowego (psf), regulując pierścień korekcyjny na obiektywie 100x, aż do uzyskania symetrycznego psf, minimalizując w ten sposób rozmycie obrazu. PSF to odpowiedź impulsowa lub odpowiedź systemu obrazowania na źródło punktowe lub obiekt punktowy.
   3. Wybierz pole widzenia z około 10 okrągłymi mikrosferami fluorescencyjnymi. Zastosuj siatkową regulację ostrości zarówno dla długości fali wzbudzenia 561 nm, jak i 488 nm jako przewodnik dla oprogramowania do analizy obrazu.
   4. Skoncentruj zarodniki w świetle transmisyjnym i uchwyć obraz światła transmisyjnego w trybie średniej 16× z ekspozycją 200 ms dla każdego obrazu.
   5. Uchwyć surowe fluorescencyjne obrazy zarodników w 3D-SIM w trybie oświetlenia "3D-SIM", ustawieniach aparatu na tryb odczytu Wzmocnienie zwielokrotnienia elektronów (EM) 10 MHz przy 14 bitach i wzmocnienie EM przy 175. Wzbudz sondę FM4-64 w zarodnikach PS4150 światłem laserowym o długości fali 561 nm przy 20% mocy lasera i czasie świecenia 400 ms.
   6. Wzbudz zarodniki GerKB-mCherry i GerD-GFP w KGB80 odpowiednio światłem laserowym o długości fali 561 nm przy 30% mocy lasera przez 1 s i światłem laserowym o długości fali 488 nm przy 60% mocy lasera przez 3 s. Ustawienia Z-Stack są w trybie od góry do dołu, krok 0,2 μm.
      NUTA: Te parametry lasera zostały zastosowane, aby zapewnić maksymalną wartość jasności około 4 000 dla okna histogramu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szkiełka szklane suszone na powietrzu	Menzel Gläser	630-2870
Obiektyw olejowy APO TIRF N20R8 100× (NA=1,49)
Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)
Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet)
Mikrosfery modyfikowane karboksylanem FluoSpheres	Invitrogen, 0,1 μm	Zobacz materiał F8803 powiedział:
FM4-64	Thermo Fisher Naukowy	F34653 powiedział:
Ośrodek gradientu gęstości niejonowej Histodenz	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D2158
Obraz J
Kamera CCD iXON3 DU-897 X-6515	Technologia Andor		https://imagej.net/Welcome
Oprogramowanie do obrazowania mikroskopowego	Nikon, Japonia	Element NIS AR 4.51.01
MilliQ Ultraczysta woda odmineryzowana	Milipory	Milli-Q IQ 7003
Mikroskop Nikon Eclipse Ti
Precyzyjne szkiełka nakrywkowe	Paweł Marienfeld	117650
Probówki z nakrętką 50 ml	Thermo Fisher Naukowy		Nunc TM