Transfekcja ameby typu dzikiego za pomocą elektroporacji ze wspomaganiem karmienia bakteryjnego

Streszczenie

Źródło: Paschke, P., et al. Inżynieria genetyczna komórek Dictyostelium discoideum w oparciu o selekcję i wzrost bakterii. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film przedstawia procedurę wprowadzania plazmidu przenoszącego gen docelowy do komórek ameby za pomocą elektroporacji, a następnie odzyskiwania w suplemencie bakteryjnym, aby umożliwić skuteczne dostarczanie genów w amebach typu dzikiego.

Protokół

1. Ustawianie komórek Dictyostelium do transfekcji
   1. Uprawiaj Klebsiella aerogenes do zbiegu w podłożu SM (mleko odtłuszczone) (podłoże bogate w składniki odżywcze) przez noc w temperaturze pokojowej (RT). Kultury mogą być przechowywane do 2 tygodni w temperaturze 4 °C.
   2. Dodać około 400 μl tej zawiesiny bakteryjnej na płytkę agarową SM (pepton 10 g/L; ekstrakt drożdżowy 1 g/L; glukoza 10 g/L; KH₂PO₄ 1,9 g/L; K₂HPO₄ x 3 H₂O, 1,3 g/L; _MgSO4 bezwodny 0,49 g/L; 1,7% agaru) i równomiernie rozprowadzić. Weź sterylną pętlę i zaszczep komórkami Dictyostelium . Rozłóż komórki na jednej krawędzi płytki.
   3. Inkubować płytkę w temperaturze 22 °C przez 2 dni, aby zapewnić wystarczająco duże strefy wzrostu do transfekcji.
      NUTA: W przypadku szczepów Dictyostelium , które nie tworzą dużych stref wzrostu (np. Ax3, DH1 lub JH10) lub dla niedoświadczonych eksperymentatorów, zamiast tego należy użyć płytek czyszczących.
   4. Weź sterylną pętlę i zaszczep komórkami Dictyostelium (około 2-4 x 10⁵ komórek). Przenieść komórki do 800 μl gęstej zawiesiny K. aerogenes w SM. Wymieszać komórki, pipetując w górę i w dół.
   5. Przenieś 400 μl, 200 μl, 100 μl i 50 μl na świeże płytki agarowe SM. Do każdej płytki dodać 400 μl dodatkowej zawiesiny SM K. aerogenes , równomiernie rozprowadzić i wysuszyć.
   6. Inkubować płytki w temperaturze 22 °C przez około 2 dni, aż staną się przezroczyste.
      NUTA: Ze względu na szybsze tempo wzrostu, bakterie początkowo wytwarzają zlewający się trawnik, a następnie ameby "oczyszczają" płytkę z bakterii. Czas potrzebny na ten proces może się różnić w zależności od tła szczepu i zdolności zmutowanych komórek do wzrostu na bakteriach.

2. Transfekcja komórek dictyostelium na podstawie selekcji bakteryjnej

1. Aby przygotować płytki z zawiesiną K. aerogenes , dodać 10 ml buforu SorMC zawierającego bakterie K. aerogenes do gęstości OD (gęstość optyczna)₆₀₀ = 2 (dodać 200 μl przygotowanego roztworu podstawowego OD₆₀₀ = 100 K. aerogenes dla pożądanego stężenia bakterii) do 10 cm płytki Petriego poddanej działaniu kultur tkankowych.
   NUTA: Płytka ta jest później potrzebna do hodowli transfekowanych komórek D. discoideum . Alternatywnie można użyć 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. W przypadku transfekcji plazmidów pozachromosomalnych 6-dołkowa płytka do hodowli tkankowej jest bardziej zasobooszczędna. Użyć 2 ml zawiesiny K. aerogenes SorMC (OD₆₀₀ = 2) na studzienkę.
2. Przygotowanie komórek Dictyostelium
   1. Używając jednorazowej pętli do inokulacji o pojemności 10 μl, zeskrobać komórki ze stref wzrostu (około 3 cm) płytki hodowlanej (krawędź oczyszczonego obszaru) lub płytki czyszczącej. Przenieś komórki do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml lodowatego buforu H40.
      NUTA: Kluczowy jest czas pobierania komórek z płytek czyszczących. Zbyt wczesny zbiór daje zbyt małą ilość komórek, podczas gdy zbyt późny zbiór zwiększa ryzyko uzyskania częściowo rozwiniętych komórek.
   2. Umyj ogniwa, obracając je w dół przez 2 minuty przy 1 000 x g lub wirując przez 2 s przy 10 000 x g. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze H40 do końcowej gęstości 2-4 x 10⁷ komórek/ml. Utrzymuj komórki w chłodzie podczas całej procedury transfekcji. Użyj zawiesiny lodowato-wodnej, aby zapewnić bezpośredni kontakt rur z lodem.
3. Elektroporacja
   1. Dodaj 100 μl komórek do probówki z 1-2 μg DNA (kwas dezoksyrybonukleinowy). Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół.
   2. Przenieś mieszaninę komórka/DNA do wstępnie schłodzonej kuwety do elektroporacji (odstęp 2 mm).
   3. Pulsuj ogniwa przy użyciu następujących ustawień fali prostokątnej: 350 V, 8 ms, 2 impulsy i interwał impulsów 1 s.
      NUTA: Nie należy dodawać więcej niż 2 μg DNA. Większe ilości są toksyczne dla komórek i zmniejszają skuteczność transfekcji. Całkowita objętość dodanego DNA nie powinna przekraczać 5 μl.
   4. Natychmiast przenieść komórki na wcześniej przygotowaną 10 cm szalkę Petriego z K. aerogenes SorMC i pozwolić komórkom dojść do siebie przez 5 godzin.
      NUTA: Sprawdź komórki na szalce Petriego pod odwróconym mikroskopem. Komórki będą wyglądały na okrągłe bezpośrednio po elektroporacji, ale powrócą do swojego ameboidalnego kształtu po około 30 minutach, kiedy będą miały wystarczająco dużo czasu, aby prawidłowo przyczepić się do powierzchni.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikrowirówki Eppendorf 5424/5424R	ThermoScientific (Nauka)	05-400-002
Wirówki Eppendorf 5702R z wirnikiem modelu A-4-38	ThermoScientific (Nauka)	12823252
Szafa bezpieczeństwa Foruna - SCANLAF	Labogen
BioPhotometer Plus	Eppendorf powiedział:
CLSM 710	Zeiss
Oczyszczony agar	Oxoid (Oxoid)	Zobacz materiał LP0028
Rosół SM	Formedium	SMB0102
2x bulion LB	Formedium	LBD0102
Kwas wolny od HEPES	Sigma Aldrich/Merck	391340 EMD
KH₂PO₄ powiedział:	Firma VWR	Nr kat. P/4800/53
Na₂HPO₄ 2H₂O	Firma VWR	10028-24-7
MgCl₂ 6H₂O	Sigma Aldrich/Merck	5982 EMD
CaCl₂ 2H₂O	Sigma Aldrich	442909
Kwas foliowy	Sigma Aldrich	F7876 powiedział:
KOH	Firma VWR	26668.263
Naczynie do hodowli tkankowej w stylu 100 x 20 mm, poddane zabiegowi hodowli tkankowej	Corning Incorporated	353003
Kuwety do elektroporacji o szczelinie 2 mm, długa elektroda	Geneflow Sp. z o.o.	E6-0062
10 μl Pętla inokulacyjna, niebieska 10 mikro l	ThermoScientific (Nauka)	129399
Rozsiewacz w kształcie litery L, sterylny	Greiner Bio-ONE	730190