Wizualizacja oddziaływań bakterii jednokomórkowych

Streszczenie

Źródło: Yarringto, K. D., et al. Kinetyczna wizualizacja jednokomórkowych międzygatunkowych oddziaływań bakteryjnych. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film przedstawia przygotowanie systemu kokultury z wykorzystaniem ruchliwych i nieruchliwych bakterii pod podkładką agarozową do obrazowania żywych komórek. Pokazuje, w jaki sposób ruchliwe bakterie wykrywają chemiczne atraktanty i atakują nieruchliwe kolonie, ujawniając interakcje bakteryjne.

Protokół

1. Przygotowanie komórek bakteryjnych i płatków do zaszczepiania

1. Zmierzyć gęstość optyczną, OD₆₀₀, każdej subkultury i rozcieńczyć Pseudomonas aeruginosa do OD₆₀₀ = 0,03 i Staphylococcus aureus do OD₆₀₀ = 0,10 w M8T (Minimalny Medium 8 + trypton) wstępnie podgrzany do 37 °C. Wymieszać P. aeruginosa i S. aureus w stosunku 1:1 i wirować.
   NUTA: Jeśli szczepy wymagają antybiotyków, można je dodawać do nocnej i subkultury, ale nie należy ich dodawać podczas mieszania gatunków do obrazowania, jeśli wpływają na inne gatunki w kokulturze. Stabilność plazmidu i wpływ antybiotyków na wszystkie gatunki w kokulturze będą musiały zostać określone dla każdego stosowanego organizmu/plazmidu.
2. Odpipetować 1 μl kokultury równomiernie na dnie wstępnie podgrzanego, sterylnego naczynia nakrywkowego ze szkła o średnicy 35 mm.
3. Usuń silikonowe wycięcie z formy za pomocą sterylnej pęsety.
4. Wyjmij wacik z naczynia za pomocą sterylnych szpatułek.
   1. Wsuń lekko wygiętą szpatułkę pod krawędź podkładki, trzymając formę do góry nogami, aby upuścić ją na sterylną pokrywkę płytki Petriego.
      NUTA: Nie wyjmuj podkładki na siłę, bo się rozerwie. Śledź, która strona podkładki jest na dole.
5. Przenieś podkładkę do naczynia z komórkami bakteryjnymi, dnem do dołu, wsuwając szpatułkę pod kątem 90° pod podkładkę i umieszczając ją na wierzchu zaszczepionego szkiełka nakrywkowego. Użyj szpatułki pod kątem 90°, aby podkładka zrównała się z szkiełkiem nakrywkowym i delikatnie wyciśnij wszelkie pęcherzyki powietrza.
6. Usuń nadmiar wilgoci z wilgotnych chusteczek i umieść je wokół krawędzi naczynia, upewniając się, że nie dotykają podkładki. Próbka jest teraz gotowa do obrazowania.

Materiały