Wzbogacanie lipoprotein bakteryjnych za pomocą niejonowej separacji faz detergentowych

Streszczenie

Źródło: Armbruster, KM, Meredith, TC Wzbogacanie lipoprotein bakteryjnych i otrzymywanie N-końcowych lipopeptydów do oznaczania strukturalnego za pomocą spektrometrii mas. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film pokazuje wzbogacanie lipoprotein bakteryjnych za pomocą niejonowego detergentu, który po podgrzaniu ulega separacji faz. Poprzez sekwencyjne zmiany temperatury i etapy wirowania, lipoproteiny są selektywnie rozdzielane na fazę detergentu, podczas gdy zanieczyszczenia nielipoproteinowe są usuwane. Wzbogacone lipoproteiny są następnie wytrącane, przemywane i ponownie zawieszane do dalszych zastosowań.

Protokół

1. Wzbogacanie lipoprotein przez partycjonowanie faz Triton X-114 (TX-114)

1. Uzupełnij lizat bakteryjny środkiem powierzchniowo czynnym TX-114 do końcowego stężenia 2% (vol/vol) dodając równą objętość 4% (vol/vol) środka powierzchniowo czynnego w lodowato zimnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej trisem/kwasem etylenodiaminotetraoctowym (TBSE) i inkubować na lodzie przez 1 godzinę, mieszając przez inwersję co ~15 min.
   NUTA: Po schłodzeniu supernatant i środek powierzchniowo czynny będą mieszalne.
2. Przenieść probówkę do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować przez 10 minut w celu wywołania separacji faz. Odwirować próbkę o masie 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby utrzymać separację dwufazową.
3. Delikatnie odpipetować górną fazę wodną i wyrzucić. Dodaj lodowato zimne TBSE do dolnej fazy środka powierzchniowo czynnego, aby napełnić probówkę do jej pierwotnej objętości i odwrócić ją do mieszania. Inkubować na lodzie przez 10 minut.
4. Przenieść probówkę do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować przez 10 minut w celu wywołania separacji faz, a następnie odwirować przy 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
5. Powtórz kroki 1.3-1.4 jeszcze raz, aby uzyskać w sumie 3 separacje. Usuń górną fazę wodną i wyrzuć.
6. Usunąć osad wytrąconych białek, które powstały w trakcie ekstrakcji (widoczny na dnie probówki), dodając 1 objętość lodowatego TBSE do fazy środka powierzchniowo czynnego. Wirować w temperaturze 4 °C przy 16 000 x g przez 2 minuty w celu osadzenia nierozpuszczalnego białka.
   NUTA: Próbka powinna pozostać jednofazowa. Jeśli nastąpi separacja faz, ponownie schłodzić próbkę i ponownie odwirować. Osad składa się na ogół z zanieczyszczeń innych niż lipoproteiny, ale może być zachowany do dalszej analizy.
7. Natychmiast przenieść supernatant do świeżej probówki mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml zawierającej 1250 μl 100% acetonu. Dokładnie pipetować w górę i w dół, aby umyć próbkę z końcówki, ponieważ będzie lepka. Wymieszać przez odwrócenie i inkubować przez noc w temperaturze -20 °C w celu wytrącenia białka.
8. Odwirować próbkę o masie 16 000 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej, aby osadzać lipoproteiny, zwracając uwagę na orientację probówki. Lipoproteiny utworzą cienką, białą warstwę wzdłuż zewnętrznej ścianki rurki.
9. Umyj granulkę dwukrotnie 100% acetonem. Zdekantować aceton i pozostawić próbkę do wyschnięcia na powietrzu.
10. Dodać 20-40 μl 10 mM chlorowodorku trisu o pH 8,0 lub standardowego buforu do próbek Laemmli SDS-PAGE i dokładnie zawiesić, pipetując w górę i w dół do ścianki z wytrąconymi lipoproteinami. Zeskrob bok probówki końcówką pipety, aby usunąć lipoproteiny.
    NUTA: Lipoproteiny nie rozpuszczają się w buforze Tris, ale raczej tworzą zawiesinę.
    1. Przechowuj lipoproteiny w temperaturze -20 °C do czasu użycia.

Materiały