Selektywne oczyszczanie białka bakteryjnego metodą chromatografii jonowymiennej

Streszczenie

Źródło: Kuo, T., et al. Jednoetapowe oczyszczanie metodą chromatografii ujemnej białka aktywującego neutrofile Helicobacter pylori z nadekspresją w Escherichia coli w trybie wsadowym. J. Vis. Exp. (2016)

Film demonstruje technikę chromatografii ujemnej w celu oczyszczenia białka związanego ze zjadliwością z lizatu bakteryjnego. Dzięki zastosowaniu dodatnio naładowanej żywicy w roztworze buforowanym, białka komórki gospodarza są selektywnie zatrzymywane, podczas gdy prawie neutralne białko docelowe pozostaje niezwiązane i jest zbierane w przepływie. Metoda ta pozwala na wydajną separację i odzysk białka docelowego do dalszych zastosowań.

Protokół

1. Ekspresja rekombinowanego HP-NAP w Escherichia coli (E. coli)

1. Przygotować plazmid pET42a-NAP zawierający sekwencję DNA białka aktywującego neutrofile Helicobacter pylori (HP-NAP) ze szczepu H. pylori 26695, jak opisano wcześniej. Przygotuj plazmidy zawierające sekwencję DNA HP-NAP z pożądanymi mutacjami punktowymi.
2. Przekształć 10 ng powyższych plazmidów DNA w kompetentne komórki E. coli BL21 (DE3) przez szok termiczny przez 45 sekund w temperaturze 42 °C, umieścić komórki na płytkach agarowych z bulionu lizogennego (LB) zawierających 50 μg/ml kanamycyny i inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.
3. Zaszczepić pojedyncze kolonie w pojedynczych probówkach zawierających 5 ml bulionu LB 50 μg/ml kanamycyny i hodować je jako kultury wstępne w temperaturze 37 °C przez 16 godzin z wytrząsaniem przy 170 obr./min.
4. Zaszczepić 2 ml powyższych komórek hodowli wstępnej w 200 ml bulionu LB zawierającego 50 μg/ml kanamycyny w kolbie o pojemności 1 l. Inkubować zaszczepioną kolbę hodowlaną w temperaturze 37 °C przez 2 godziny z wytrząsaniem przy 170 obr./min, aż absorbancja przy 600 nm osiągnie około 0,4-0,5 wykryta przez spektrofotometr w ultrafiolecie widzialnym (UV/VIS).
5. Dodać 80 μl 1 M izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) do powyższej kultury do końcowego stężenia 0,4 mM w celu wywołania ekspresji HP-NAP. Inkubować kulturę przez 3 godziny, aż absorbancja przy 600 nm osiągnie około 1,6-1,7.
6. Odwirować komórki w temperaturze 6 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut w celu usunięcia supernatantu. Przechowywać osad komórkowy w temperaturze -70 °C do czasu oczyszczenia.

2. Przygotowanie rozpuszczalnej frakcji białkowej zawierającej HP-NAP

NUTA: Wszystkie poniższe etapy przeprowadza się w temperaturze 4 °C.

1. Zawiesić 50 ml osadu komórkowego przygotowanego w kroku 1.6 protokołu w 20 ml 20 mM Tris-HCl o pH 9,0, 50 mM NaCl zawierającym 0,13 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF), 0,03 mM N-alfa-tozylo-L-lizynylo-chlorometyloketonu (TLCK) i 0,03 mM N-tozylo-L-fenyloalaninylo-chlorometyloketonu (TPCK) w temperaturze 4 °C, jak opisano wcześniej.
2. Rozbić komórki bakteryjne, przepuszczając zawiesinę bakteryjną przez homogenizator wysokociśnieniowy działający w zakresie od 15 000 do 20 000 psi przez 7 razy w temperaturze 4 °C.
3. Odwirować lizat komórkowy w temperaturze 30 000 × g w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę w celu oddzielenia rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych frakcji białkowych za pomocą ultrawirówki. Przenieść supernatant w postaci rozpuszczalnej frakcji białkowej do zlewki.
4. Zmierzyć stężenie białka w rozpuszczalnej frakcji białkowej metodą Bradforda przy użyciu komercyjnego zestawu z albuminą surowicy bydlęcej (BSA) jako wzorcem, zgodnie z instrukcjami producenta.
5. Dodać 177,6 μl 1 N HCl do 20 ml rozpuszczalnej frakcji białkowej otrzymanej z kroku 2.3 Protokołu, aby dostosować jej wartość pH z pH 9,0 do pH 8,0.
6. Dodać 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl do powyższego roztworu białkowego, aby uzyskać końcowe stężenie białka 0,5 mg/ml.

3. Oczyszczanie rekombinowanego HP-NAP z E. coli za pomocą chromatografii wsadowej w trybie ujemnym z żywicami jonowymiennymi DEAE

1. Przygotować 15 ml żywic dietyloaminoetylowych (DEAE).
   1. Odważyć 0,6 g suchego proszku żywic DEAE i zawiesić go w 30 ml 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 dzień.
   2. Odwirować żywicę w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 1 min.
   3. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.
   4. Dodać 15 ml 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl.
   5. Powtórz kroki protokołu od 3.1.2 do 3.1.4 jeszcze cztery razy.
   6. Przechowywać 15 ml osiadłej żywicy (50% zawiesiny w 30 ml buforu Tris) w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia.
      NUTA: Wszystkie poniższe etapy przeprowadza się w temperaturze 4 °C.
2. Dodać 45 ml rozpuszczalnych białek przygotowanych w kroku 2.6 protokołu do 15 ml żywicy i mieszać zawiesinę białkowo-żywiczną mieszadłem magnetycznym w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
3. Wlać zawiesinę białka/żywicy do plastikowej lub szklanej kolumny wyposażonej w zawór odcinający. Pozwól, aby żywica osiadła pod wpływem grawitacji.
4. Otwórz kurek, aby roztwór białkowy mógł przepływać przez kolumnę przez przepływ grawitacyjny, aż poziom cieczy w kolumnie znajdzie się tuż nad żywicą. Zebrać przepływ jako frakcję niezwiązaną, która zawiera oczyszczony HP-NAP.
5. Dodać do kolumny 15 ml lodowatego 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl.
6. Otworzyć kurek, aby bufor płuczący mógł przepływać przez kolumnę za pomocą przepływu grawitacyjnego, aż poziom cieczy w kolumnie znajdzie się tuż nad żywicą. Zebrać przepływ jako frakcję płuczącą.
7. Powtórz kroki protokołu od 3.5 do 3.6 jeszcze cztery razy, aby zebrać dodatkowe frakcje płukania.

Materiały