Procedura oczyszczania białka znakowanego polihistydyną ze Streptococcus mutans

Streszczenie

Źródło: Murata, T., et al. Oczyszczanie białka o wysokiej masie cząsteczkowej w Streptococcus mutans. J. Vis. Exp. (2019)

Ten film pokazuje krok po kroku procedurę oczyszczania białka znakowanego polihistydyną wydzielanego przez Streptococcus mutans.

Protokół

1. Skoncentrować białka z supernatantu hodowli przez wytrącanie siarczanu amonu.
   NUTA: Ekstrakt z ciał komórkowych, jeśli białko docelowe jest wewnątrzkomórkowe.
   1. Zawiesinę kultury bakterii (Streptococcus mutans) odwirować przez 20 minut w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C. Odzyskać supernatant kultury do szklanej zlewki o pojemności 3 l.
   2. Dodać 1,122 g siarczanu amonu do 2 l supernatantu (80% nasycenia), energicznie mieszając za pomocą mieszadła magnetycznego. Pozostawić osad do uformowania się osadu przez 4 godziny lub dłużej w temperaturze 4 °C, mieszając.
      NUTA: Tworzenie osadu można kontynuować przez noc.
   3. Odwirować roztwór wytrącony siarczanem amonu o stężeniu 15 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant.
   4. Zebrać osad szpatułką i przenieść do szklanej zlewki o pojemności 200 ml. Zawiesić osady w 35 ml buforu wiążącego (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 5 mM imidazolu, pH 8,0).
   5. Zawiesinę należy dializować w stosunku do 2 500 ml buforu wiążącego za pomocą rurki do dializy z regenerowanej celulozy, w temperaturze 4 °C, mieszając. Po 2 godzinach należy wymienić roztwór do dializy i kontynuować dializę przez noc.
   6. Ponownie wymienić roztwór dializacyjny. Kontynuuj dializę przez dodatkowe 2 godziny.
2. Odwirować dializowaną zawiesinę o stężeniu 20 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przefiltrować supernatant przez filtr membranowy za pomocą sprzętu do filtracji ssącej. Przenieść filtrat do kolby o średnicy^{75 cm2} .
3. Frakcjonować glukozylotransferazę-SI ZNAKOWANĄ POLIHISTYDYNĄ (GTF-SI) z przefiltrowanej zawiesiny metodą chromatografii powinowactwa do metali immobilizowanych (IMAC).
   1. Przenieść 2 ml zawiesiny żywicy IMAC z ładunkiem niklu (około 1 ml żywicy) do kolumny chromatograficznej, której wylot jest podłączony do rurki silikonowej. Usunąć roztwór do przechowywania za pomocą przepływu grawitacyjnego.
      OSTROŻNOŚĆ: Nie pozwól, aby żywica wyschła w całym IMAC.
   2. Dodaj 3 ml wody destylowanej do kolumny, aby przepłukać żywicę. Dodać 5 ml buforu wiążącego, aby zrównoważyć żywicę.
   3. Odciąć przepływ za pomocą kurka szczypcowego Hoffmanna. Dodać 5 ml przefiltrowanej zawiesiny z kroku 2, aby uzyskać zawiesinę.
   4. Dodać całą gnojowicę do pozostałej przefiltrowanej zawiesiny. Delikatnie mieszać mieszaninę przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
   5. Załaduj mieszaninę z powrotem na kolumnę. Usunąć zawiesinę za pomocą przepływu grawitacyjnego. Przemyć żywicę IMAC 20 ml buforu wiążącego.
      NUTA: Dostosuj natężenie przepływu do około 2 ml/min za pomocą kurka zaciskowego Hoffmann przez cały kolejny IMAC.
   6. Eluować rekombinowany GTF-SI za pomocą 20 ml buforu elucyjnego (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 500 mM imidazolu, pH 8,0).
      NUTA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Eluat należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Żywica IMAC może być ponownie użyta.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odśrodkowa jednostka ultrafiltracji	Sartorius Sartorius (Wyspa Sar	VS2032 powiedział:	Wymiana buforu i zagęszczenie białka
Wirówka	Kubota	Zobacz materiał 7780II
Kolumna chromatograficzna	Bio-Rad	7321010	Dla IMAC
Zacisk membranowy do dializy	Marka Fisher	21-153-100
Rurki do dializy	Jako jedność	2-316-06
Imidazol	Wako	095-00015	Przygotowanie buforu wiążącego i buforu elucyjnego
Inkubator	Instrumenty medyczne i chemiczne Nippon	LH-100-RDS	Ustawienie temperatury: 37 °C
Mikrowirówka	Kubota	3740
Chlorek sodu	Wako	191-01665	Przygotowanie buforu wiążącego i buforu elucyjnego
Diwodorofosforan sodu dwuwodny	Wako	192-02815	Przygotowanie buforu wiążącego i buforu elucyjnego
Wodorotlenek sodu	Wako	198-13765	Przygotowanie buforu wiążącego i buforu elucyjnego
Siarczan amonu	Wako	015-06737	Wytrącanie siarczanu amonu
Żywica naładowana niklem	Bio-Rad	1560133	Dla IMAC
Filtr membranowy	Merck Millipore	JGWP04700	Średnica 0,2 μm