Mikroprzepływowa mikroskopia poklatkowa do badania trwałości antybiotyków w bakteriach

Abstract

Źródło: Oms, T., et al. Analiza populacyjna i jednokomórkowa trwałości antybiotyków w Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2023)

Ten film przedstawia protokół monitorowania poszczególnych komórek bakteryjnych wykazujących ekspresję znakowanego fluorescencyjnie białka wiążącego DNA w układzie mikroprzepływowym. Ilustruje to, w jaki sposób antybiotyki hamują większość komórek, podczas gdy subpopulacja komórek przetrwałych przeżywa leczenie i odrasta po usunięciu antybiotyku.

Protocol

Obrazowanie mikroskopem poklatkowym mikroprzepływowym

NUTA: W poniższej sekcji opisano przygotowanie płytki mikroprzepływowej, a także procedurę akwizycji i analizy obrazu poklatkowego. Celem tego eksperymentu jest obserwacja i analiza fenotypu trwałości po leczeniu antybiotykami na poziomie pojedynczej komórki. Dane zebrane podczas tego eksperymentu mogą być wykorzystane do wygenerowania szerokiego zakresu wyników w zależności od zadanego pytania i/lub reporterów fluorescencyjnych użytych podczas eksperymentu. W opisanym tu eksperymencie przeprowadzono analizę ilościową długości komórek i fluorescencji HU-mCherry, odzwierciedlającą organizację nukleoidu w komórkach trwałych i nietrwałych.

1. Hodowla komórek bakteryjnych w mikroprzepływowej mikroskopii poklatkowej
   1. Zaszczepić 5 ml pożywki (kwas 3-[N-morfolino] propanosulfonowy (MOPS) glicerolu 0,4%, w razie potrzeby uzupełnionej selektywnym antybiotykiem) izolowaną kolonią w szklanej probówce (≥25 ml) i umieścić probówkę w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na 37 °C i 180 obr./min przez noc (między 15 godzinami a 19 godzinami).
   2. Następnego dnia zmierzyć OD₆₀₀ nm i rozcieńczyć kulturę w świeżej pożywce o dostosowanej temperaturze (37 °C, MOPS glicerol 0,4%) w szklanej probówce do końcowego OD₆₀₀ nm ~0,001. Pozostawić kulturę do wzrostu przez noc (między 15 godziną a 19 godziną) w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i 180 obr./min, aby następnego dnia uzyskać wczesną kulturę w fazie wykładniczej.
2. Przygotowanie płytki mikroprzepływowej i obrazowanie mikroskopem poklatkowym
   NUTA: Eksperymenty mikroprzepływowe mogą być przeprowadzane w dostępnych na rynku urządzeniach mikroprzepływowych (zgodnie z opisem tutaj) lub w systemach mikroprzepływowych produkowanych we własnym zakresie.
   1. Usunąć roztwór konserwujący (jeśli jest) z każdej studzienki płytki mikroprzepływowej i zastąpić go świeżą pożywką hodowlaną.
      NUTA: Jeśli płytka mikroprzepływowa zawiera studzienkę odpływową, roztwór konserwujący ze studzienki wylotowej powinien zostać usunięty, ale nie zastąpiony przez medium.
   2. Uszczelnij płytkę mikroprzepływową za pomocą systemu kolektora, klikając przycisk Seal lub za pomocą oprogramowania mikroprzepływowego (najpierw wybierz Narzędzie, a następnie Płytka uszczelniająca).
      NUTA: Aby uszczelnić płytę, należy przyłożyć równomierny nacisk na płytę i kolektor, ręcznie dociskając płytkę do kolektora. Jeśli zostanie to wykonane poprawnie, na interfejsie ONIX2 powinna pojawić się notatka "zapieczętowana". Ważne jest, aby nie wywierać żadnego nacisku na szkiełko, aby uniknąć potencjalnego ryzyka pęknięcia kolektora.
   3. Po uszczelnieniu wykonaj pierwszą sekwencję zalewania (kliknij Uruchom sekwencję zalewania cieczą w interfejsie oprogramowania mikroprzepływowego).
      UWAGA: Uruchom sekwencję zalewania cieczą odpowiada 5 minutom perfuzji przy 6,9 kPa dla studzienek 1-5, następnie 5 minutom perfuzji przy 6,9 kPa dla studzienki 8 i końcowej rundzie perfuzji dla studni 6 przez 5 minut przy 6,9 kPa. Sekwencja zalewania Run Liquid umożliwia usunięcie roztworu konserwującego, który może być nadal obecny w kanałach łączących różne studnie.
   4. Inkubować płytkę w termostatycznie sterowanej komorze mikroskopu w żądanej temperaturze (w tym przypadku 37 °C) przez co najmniej 2 godziny przed rozpoczęciem obrazowania mikroskopowego.
   5. Rozpocznij drugą sekwencję zalewania cieczą przed rozpoczęciem eksperymentu.
   6. Uszczelnij płytkę mikroprzepływową, klikając przycisk Seal off w interfejsie oprogramowania mikroprzepływowego. Zastąpić pożywkę w studzience 1 i basenie 2 200 μl świeżej pożywki, w studzience 3 200 μl świeżej pożywki zawierającej antybiotyk (w tym przypadku ofloksacynę (OFX) w stężeniu 5 μg·mL⁻¹), w studzience 4 i 5 200 μl świeżej pożywki, w studzience 6 200 μl świeżej pożywki, oraz w studzience 8 z 200 μl próbki kultury (z etapu 1.2) rozcieńczonej do OD₆₀₀ nm 0,01 w świeżej pożywce.
   7. Uszczelnij płytkę mikroprzepływową zgodnie z opisem w kroku 2.2 i umieść ją na obiektywie mikroskopu wewnątrz szafki mikroskopu.
      NUTA: Upewnij się, że umieściłeś kroplę olejku immersyjnego na obiektywie mikroskopu przed umieszczeniem płytki mikroprzepływowej.
   8. W oprogramowaniu mikroprzepływowym kliknij Ładowanie komórek , aby umożliwić załadowanie komórki do płytki mikroprzepływowej.
      NUTA: Etap ładowania komórki obejmuje 15 s perfuzji przy 13,8 kPa dla dołka 8, następnie 15 s perfuzji przy 27,6 kPa dla dołka 6 i dołka 8 oraz końcową rundę perfuzji dla dołka 6 przez 30 s przy 6,9 kPa. Gęstość komórek w płytce mikroprzepływowej ma kluczowe znaczenie dla eksperymentu. Pierwsza część tego protokołu mikroprzepływowego polega na hodowaniu bakterii przez 6 godzin w świeżej pożywce przed antybiotykoterapią. Po 6 godzinach wzrostu gęstość komórek musi być wystarczająca do wykrycia rzadkich komórek trwałych (w warunkach zastosowanych w tym badaniu, komórki trwałe generują się z częstotliwością 10⁻⁴). Jeśli zagęszczenie komórek jest zbyt duże, trudno jest rozróżnić poszczególne komórki, co uniemożliwia precyzyjną analizę pojedynczych komórek. Ponieważ szybkość wzrostu jest bezpośrednio zależna od pożywki, gęstość komórek w polach mikroskopowych powinna być oceniona przed rozpoczęciem eksperymentu.
   9. Ustaw optymalną ostrość w trybie światła przechodzącego i wybierz kilka obszarów zainteresowania (ROI), w których obserwuje się odpowiednią liczbę komórek (do 300 komórek na pole).
      NUTA: Wybierz co najmniej 40 ROI, aby upewnić się, że rzadkie komórki trwałe są obrazowane.
   10. W oprogramowaniu mikroprzepływowym kliknij Utwórz protokół. Zaprogramować wstrzyknięcie świeżej pożywki o ciśnieniu 6,9 kPa przez 6 godzin (studzienka 1-2), następnie wstrzyknięcie pożywki zawierającej antybiotyk o ciśnieniu 6,9 kPa przez 6 godzin (studzienka 3), a na końcu wstrzyknięcie świeżej pożywki o ciśnieniu 6,9 kPa przez 20 godzin (studzienki 4-5).
       NUTA: Kultura bakteryjna rozcieńczona do OD₆₀₀ nm 0,01 pozwala bakteriom rosnąć w komorze mikroprzepływowej przez 6 godzin, zapewniając, że komórki znajdują się w fazie wzrostu wykładniczego. W zależności od liczby komórek wprowadzonych do urządzenia mikroprzepływowego podczas etapu ładowania (patrz krok 2.8), czas trwania fazy wzrostu można dostosować do uzyskania do 300 komórek na zwrot z inwestycji. Ponieważ trwałość jest rzadkim zjawiskiem, zwiększenie liczby komórek na ROI poprawia możliwość obserwacji komórek trwałych. Liczba komórek nie powinna jednak przekraczać 300 komórek na ROI, ponieważ sprawia to, że analiza pojedynczych komórek jest żmudna.
   11. Wykonuj obrazowanie mikroskopowe w trybie poklatkowym z jedną klatką co 15 minut przy użyciu światła przechodzącego i źródła światła wzbudzającego dla reportera fluorescencyjnego. W tym przypadku zastosowano źródło światła wzbudzającego 560 nm dla sygnału mCherry (dioda LED 580 nm o mocy 10% z filtrem 00 [530-585 ex, 615LP em, Zeiss] i ekspozycją 100 ms dla mCherry). Do obrazowania komórek wykorzystano oprogramowanie Zen3.2 kompatybilne z firmą Zeiss.
3. Analiza obrazu
   NUTA: Otwieranie i wizualizacja obrazów mikroskopowych odbywa się za pomocą oprogramowania ImageJ/Fiji (https://fiji.sc/ o otwartym kodzie źródłowym). Ilościowa analiza obrazu jest wykonywana za pomocą oprogramowania ImageJ/Fiji o otwartym kodzie źródłowym oraz bezpłatnej wtyczki MicrobeJ (https://microbej.com). W tym protokole użyto wersji MicrobeJ 5.13I(14).
   1. Otwórz oprogramowanie ImageJ/Fiji na komputerze i przeciągnij obrazy z mikroskopii poklatkowej hyperstack na pasek ładowania Fidżi. Użyj opcji Image > Color > Create Composite , aby połączyć różne kanały hyperstack. Jeśli kanały w eksperymencie poklatkowym nie odpowiadają pożądanemu kolorowi (np. kontrast fazowy jest pokazany na czerwono zamiast na szaro), użyj opcji Obraz > Kolor > Rozmieść kanały , aby zastosować odpowiedni kolor do kanałów.
   2. Otwórz wtyczkę MicrobeJ i wykryj komórki bakteryjne za pomocą ręcznego interfejsu edycji. Usuń automatycznie wykryte komórki i ręcznie obrysuj interesujące komórki trwałe klatka po klatce.
      NUTA: Do automatycznego wykrywania pojedynczych komórek można użyć różnych ustawień. Zastosowano tutaj detekcję ręczną, ponieważ analizowane komórki trwałe tworzą długie włókna, które rzadko są wykrywane poprawnie za pomocą automatycznej detekcji.
   3. Po wykryciu użyj ikony Wynik w interfejsie ręcznej edycji MicrobeJ, aby wygenerować tabelę ResultJ. Zapisz plik ResultJ i użyj go, aby uzyskać wgląd w różne parametry będące przedmiotem zainteresowania w analizie pojedynczej komórki. W tym protokole wyeksportowano średnią fluorescencję intensywności HU-mCherry, długość komórki i obszar komórek poszczególnych komórek.

Materials