Badania przesiewowe cyklicznych modulatorów di-GMP z wykorzystaniem bakterii wyrażających fluorescencyjne białko reporterowe

Abstract

Źródło: Rugjee, K. N., et al. Opracowanie wysokoprzepustowego zestawu do badań przesiewowych małych cząsteczek, które modulują sygnalizację c-di-GMP u Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2016).

Ten film przedstawia badania przesiewowe cyklicznych modulatorów di-GMP przy użyciu genetycznie zmodyfikowanych bakterii, które eksprymują białko zielonej fluorescencji (GFP) pod kontrolą promotora wrażliwego na c-di-GMP. Fluorescencję mierzy się na płytce wielodołkowej zawierającej różne badane związki. Związki hamujące produkcję c-di-GMP prowadzą do zmniejszenia fluorescencji. Dane są następnie analizowane w celu identyfikacji potencjalnych modulatorów sygnalizacji c-di-GMP u bakterii.

Protocol

1. Wytwarzanie białka zielonej fluorescencji (GFP) Tagged cykliczny di-GMP (c-di-GMP) Reporter Szczep Pseudomonas aeruginosa

1. Zaszczepić 5 ml pożywki bulionu lizogenicznego (LB) pojedynczą kolonią P. aeruginosa i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
2. Przenieść 2 ml kultury na noc do 200 ml świeżej pożywki LB w kolbie o pojemności 1 l i inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
3. Monitorować gęstość optyczną przy długości fali 600 nm (OD₆₀₀) co 30 minut, pobierając próbkę o objętości 1 ml z kolby i badając ją za pomocą spektrofotometru.
4. Gdy OD₆₀₀ osiągnie między 0,3 a 0,5, umieść 40 ml kultury w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
5. Osadzać komórki przez odwirowywanie z prędkością 8 000 obr./min przez 10 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 40 ml lodowatego, sterylnego roztworu sacharozy o sacharozie o stężeniu 300 mM.
6. Osadzać komórki po raz drugi przez odwirowanie zgodnie z opisem w kroku 1.5 i ponownie zawiesić w 20 ml lodowatego, sterylnego roztworu sacharozy o sile 300 mM.
7. Osadzać komórki po raz ostatni przez odwirowanie zgodnie z opisem w kroku 1.5 i ponownie zawiesić w 400 μl lodowatego, sterylnego roztworu sacharozy o stężeniu 300 mM.
   Uwaga: Gęstość komórek w tym momencie powinna wynosić około 1 x 10¹¹ jednostek tworzących kolonie na mililitr (CFU/ml).
8. Schładzamy ogniwa na lodzie przez 30 minut, po czym są gotowe do elektroporacji.
9. Dodać 1 μl roztworu plazmidu o stężeniu 0,2 μg/μl pCdrA::gfp^C do 40 μl elektrokompetentnych komórek P. aeruginosa przygotowanych powyżej w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, która została wstępnie schłodzona na lodzie. Wymieszać zawiesinę i przenieść ją do wstępnie schłodzonej kuwety elektrodowej o średnicy 2 mm.
10. Usuń wilgoć z zewnętrznej strony kuwety za pomocą bibuły i umieść kuwetę w komorze na próbki elektroporatora. Impuls o napięciu 2,5 kV, pojemności 25 μF i rezystancji 200 Ω.
11. Wyjmij kuwetę i dodaj 1 ml pożywki LB. Następnie przenieść komórki do sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
12. Rozprowadzić 10 μl, 50 μl i 100 μl podwielokrotności kultury na sterylnych płytkach z agarem LB uzupełnionych ampicyliną (w stężeniu 100 μg/ml) i inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc.
13. Potwierdzić ekspresję GFP (wzbudzenie przy 485 nm, emisja przy 520 nm) badając płytkę pod mikroskopem fluorescencyjnym ze standardowym kanałem GFP i wybrać pojedynczą kolonię do zaszczepienia 5 ml LB. Inkubować przez noc, jak opisano w kroku 1.1. Zmieszać 0,5 ml nocnej hodowli z 0,5 ml 50% glicerolu w 2 ml zakręcanej probówce i przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Przygotowanie kultury starterowej do zaszczepienia

1. Dwa dni przed badaniem przesiewowym należy rozprowadzić szczep P. aeruginosa (zawierający plazmid ^C pCdrA::gfp) z zapasu w temperaturze -80 °C na płytce LB-agar (uzupełnionej ampicyliną w stężeniu 100 μg/ml), delikatnie rozprowadzając bakterie na płytce za pomocą sterylnej pętli inokulacyjnej. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C.
2. Wieczorem przed badaniem przesiewowym należy zaszczepić pojedynczą kolonię P. aeruginosa z płytki w 10 ml pożywki LB (uzupełnionej ampicyliną o stężeniu 100 μg/ml) w probówce i inkubować hodowlę wstępną przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
3. W dniu badania przesiewowego przygotuj subkulturę z nocnej hodowli wstępnej, rozcieńczając ją najpierw świeżą pożywką LB do OD₆₀₀ 1,0, a następnie dalej rozcieńczając 5% LB do OD₆₀₀ 0,04 (stosunek 1:25).
   Uwaga: Całkowita objętość zaszczepionej pożywki zależy od liczby płytek, które mają być badane. 5% LB wytwarza się przez rozcieńczenie 100% LB solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do wymaganego stężenia. Co ważne, pożywka (5% LB) umożliwia konstytutywną aktywację pCdrA::gfp^C u P. aeruginosa.
4. Dodaj sterylne mieszadło magnetyczne do pojemnika i mieszaj kulturę z minimalną prędkością na mieszadle magnetycznym przez 30 minut w temperaturze pokojowej, pozwalając bakteriom zaaklimatyzować się w pożywce przed dozowaniem do płytek 384-dołkowych.

3. Inokulacja i inkubacja 384-dołkowych płytek zawierających małe cząsteczki

Uwaga: Sterylność i dobre techniki aseptyczne mają kluczowe znaczenie dla następujących kroków.

1. Aby przygotować kontrolę pozytywną (100% inhibicja), dodać 20 μl siarczanu tobramycyny (25 mg/ml) do 10 ml (odpowiednio na maksymalnie 12 płytek) subkultury przygotowanej w kroku 2.3 i delikatnie wymieszać. Odpipetować 40 μl kultury kontroli dodatniej do studzienek A23-P23 (ryc. 1).
2. Aby przygotować kontrolę ujemną (inhibicja 0%), dodać 30 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) do 10 ml (odpowiednio na maksymalnie 12 płytek) subkultury przygotowanej w kroku 2.3 i delikatnie wymieszać. Odpipetować 40 μl kultury kontroli ujemnej do studzienek A24-P24 (ryc. 1).
3. Dla każdej z płytek oznaczonych małymi cząsteczkami, zaszczepić objętość 40 μl rozcieńczonych kultur na noc (opisanych w kroku 2.3) do studzienek A1-P22 (Rysunek 1).
   Uwaga: Można to osiągnąć za pomocą robota do obsługi cieczy. Ze względu na niejednorodne właściwości kultur bakteryjnych ważne jest utrzymanie ciągłego i umiarkowanego mieszania, aby bakterie były równomiernie rozmieszczone w pożywce podczas dozowania. Aby to zrobić, podczas dozowania należy mieszać magnetycznie zaaklimatyzowaną kulturę z kroku 2.4.
4. Uszczelnić płytki przepuszczalną dla powietrza pokrywą, uszczelnić i inkubować przez 6 godzin w temperaturze 37 °C.
   Uwaga: Uszczelnienie przepuszczające powietrze ma kluczowe znaczenie dla utrzymania niezmiennych warunków we wszystkich 384 studzienkach i uniknięcia potencjalnego rozwoju gradientów tlenu na płycie.

4. Pomiar wzrostu (OD600) i wewnątrzkomórkowego poziomu c-di-GMP (GFP)

1. Około 30 minut przed pomiarem spektrofotometrycznym należy podgrzać czytnik płytek do temperatury 37 °C, aby uniknąć kondensacji.
2. Przed czytaniem delikatnie zdejmij przepuszczającą powietrze uszczelkę pokrywy. Zmierz gęstość optyczną przy długości fali 600 nm przy ustawieniu 10 błysków na studzienkę i czasie ustalania 0,2 sekundy.
3. Przed pomiarem fluorescencji należy dokonać automatycznej regulacji wzmocnienia i ogniskowej w oparciu o basenik A24 (kontrola ujemna) i ustawić docelową wartość wzmocnienia na 75% (ryc. 1).
   1. W oprogramowaniu sterującym czytnikiem płytek kliknij na rozpocznij pomiar i kliknij na zakładkę ''Regulacja ostrości i wzmocnienia/ID płyty''.
   2. Wybierz ''Regulacja ostrości'' i ''Kanał A'' po prawej stronie okna.
   3. Wybierz ''Regulacja wzmocnienia'' i ''Dobrze wybrane'', a następnie wpisz ''75'' jako ''Wartość docelowa''. Na koniec wybierz dobrze A24 w układzie tabliczek, zanim klikniesz na ''Rozpocznij korektę''. Po dokonaniu regulacji kliknij na ''Rozpocznij pomiar''.
   4. Zmierzyć fluorescencję z reportera GFP przy maksimum wzbudzenia/emisji 485/520 nm przy ustawieniu 10 błysków na studzienkę i czasie ustalania 0,2 sekundy.
4. Zbierz dane ze wszystkich badanych płyt.
   Uwaga: Odczyty danych są automatycznie zapisywane jako domyślne przez oprogramowanie sterujące czytnikiem płytek.
   1. View odczyty, klikając ikonę "Mars" w oprogramowaniu sterującym, aby otworzyć pakiet analizy statystycznej.
   2. Pobierz dane, klikając dwukrotnie na interesujący Cię numer rejestracyjny, aby uzyskać dostęp do danych do analizy.

Results

Rysunek 1. Mapa płytki z 384 dołkami używana do testu przesiewowego małych cząsteczek. Związki z biblioteki (jasnoniebieskie) są rozdzielane na porcje do studzienek A1-P22. "Kontrola pozytywna" (kolor czerwony), składająca się z końcowego stę...

Materials