Technika przygotowania monoklonalnej kultury bakteryjnej

Streszczenie

Źródło: Lin, P., et al. Synteza wolframianu sodu i mikrokapsułek molibdenianu sodu poprzez bakteryjne wydalanie minerałów. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film przedstawia przygotowanie monoklonalnej kultury bakteryjnej do produkcji minerałów poprzez seryjne rozcieńczanie i izolację kolonii na płytce agarowej. Potrząsając płytką ze szklanymi kulkami, poszczególne komórki są przestrzennie rozdzielane, tworząc genetycznie jednolite kolonie, które są następnie przenoszone do płynnych pożywek w celu wzrostu. Wybierana jest kultura o najwyższym zmętnieniu, wskazująca na najgęstszą populację monoklonalną i największy potencjał produkcji mineralnej.

Protokół

1. Przygotowanie szklanych koralików

1. Umieść 100 szklanych koralików o średnicy 3 mm w butelce laboratoryjnej o pojemności 100 ml, a następnie szczelnie ją zakorkuj.
2. Zawartość należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 120 °C przez 10 min.
3. Pozostaw butelkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej, a następnie umieść ją w szafie bezpieczeństwa biologicznego.

2. Przygotowanie bulionu lizogennego (LB)

1. Rozpuść 8 g proszku bulionu LB-Lennox w butelce laboratoryjnej o pojemności 500 ml z 400 ml wody.
2. Mieszaj zawartość za pomocą mieszadła magnetycznego z politetrafluoroetylenu (PTFE) przez 20 minut, a następnie szczelnie zakrępuj.
3. Zawartość należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 120 °C przez 10 min.
4. Pozostaw roztwór do ostygnięcia do temperatury pokojowej i umieść go w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
5. Za pomocą pipety przelej bulion na osiem 15 ml probówek wirówkowych (po 12,5 ml każda) w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
6. Pozostałą ilość bulionu rozmieścić w trzech butelkach laboratoryjnych o pojemności 100 ml w komorze bezpieczeństwa biologicznego (każda o pojemności 100 ml każda). Szczelnie zakręć trzy butelki. Przechowuj je w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

3. Kultura glonów Shewanella

1. Użyj głęboko zamrożonego szczepu kriokonserwowanego.
2. W komorze bezpieczeństwa biologicznego za pomocą szpatułki ze stali nierdzewnej pobrać 1 ml zamrożonego materiału z zamrożonej probówki i umieścić go w probówce wirówkowej przygotowanej w kroku 3.5.
3. Inkubować kultury przez 24 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C.

4. Przygotowanie szalek Petriego LB-Lennox (rosół z agarem)

1. Rozpuść dwie tabletki LB-Lennox (bulion z agarem) w 100 ml butelce laboratoryjnej ze 100 ml wody.
2. Mieszaj zawartość za pomocą mieszadła magnetycznego z PTFE przez 20 minut, a następnie szczelnie przykryj.
3. Zawartość należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 120 °C przez 10 min.
4. W komorze bezpieczeństwa biologicznego ręcznie rozlej 100 ml roztworu na 4 szalki Petriego, upewniając się, że każda z nich otrzyma ~25 ml. Pozostaw roztwór do ostygnięcia do temperatury pokojowej.

5. Przygotowanie bakterii monoklonalnych

1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego oznacz trzy butelki przygotowane odpowiednio w kroku 2.6, #1, #2 i #3.
2. Odpipetować 0,1 ml powstałej zawiesiny bakteryjnej w kroku 3.3 do butelki #1. Zakręć butelkę i obracaj nią ręcznie przez 1 minutę, aby uzyskać jednorodny roztwór.
3. Odpipetować 0,1 ml powstałego płynu bakteryjnego w kroku 5.2 do butelki #2. Zakręć butelkę i obracaj nią ręcznie przez 1 minutę, aby uzyskać jednorodny roztwór.
4. Odpipetować 0,1 ml powstałego płynu bakteryjnego w kroku 5.3 do butelki #3. Zakręć butelkę i potrząsaj nią ręcznie przez 1 minutę, aby uzyskać jednorodny roztwór.
5. Odpipetować płyn z butelki #3 do 4 szalek Petriego przygotowanych w kroku 4.4, używając objętości 0,02 ml każda.
6. Umieść szklane koraliki przygotowane w kroku 1.3 do 4 używanych szalek Petriego, po 4 koraliki w każdym naczyniu.
7. Zamknij pokrywki szalek Petriego i potrząsaj nimi ręcznie przez 1 minutę.
8. Odwrócić szalki Petriego do góry nogami i inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 24 godziny.

6. Namnażanie bakterii monoklonalnych

1. Pobierz 7 probówek przygotowanych w kroku 2.5.
2. Za pomocą szpatułki ze stali nierdzewnej należy wybrać powstałe bakterie monoklonalne z 4 szalek Petriego przygotowanych w kroku 5.8 i umieścić je osobno w 7 probówkach.
3. Pozostawić 7 probówek w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 24 godziny.
4. Wybierz ten z największym rozproszeniem światła za pomocą wizualnej metody kolorymetrycznej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
LB (bulion Lennox) z tabletkami agarowymi	Sigma-Aldrich	L7075	1 tabletka na 50 ml bulionu z agarem
LB (bulion Lennoxa)	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	LB (Lennox) proszek 1 kg
Dekstroza bezwodna	Odczynnik Nihon Shiyaku	PL 78695	glukoza
Probówka wirówkowa 50 ml	Sokół	14-432-22
Probówka wirówkowa 15 ml	Sokół	14-959-53A
Butelka laboratoryjna 100 ml	Duran	21 801 24 5
Butelka laboratoryjna 500 ml	Duran	21 801 44 5
Szpatułka ze stali nierdzewnej	Szkło chemiczne	CG-1981-10
Jednorazowe mieszadła z PTFE	Rybak	S68066 powiedział:
Plastikowe szalki Petriego	Rybak	S33580A
Inkubator	Wykonane przez klienta	Wykonane na zamówienie	podgrzać do 40 °C lub schłodzić do 18 °C z kotrolem czasowym
Szafa bezpieczeństwa biologicznego	Zong Yen co., Sp. z o.o.	ZYBH-420	Wszystkie procesy związane z bakteriami odbywają się tutaj
Autoklaw	Tomin Medical Equipmenco, Ltd., Tajpej, Tajwan, Republika Chińska	TM-329 powiedział:	podgrzewać do 120 °C przez 10 min