Synteza mikrokapsułek tlenków metali z wykorzystaniem bakterii redukujących metale

Streszczenie

Źródło: Lin, P., et al. Synteza wolframianu sodu i mikrokapsułek molibdenianu sodu poprzez bakteryjne wydalanie minerałów. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film przedstawia procedurę syntezy sztywnych mikrokapsułek z tlenku metalu poprzez hodowlę bakterii redukujących metale za pomocą jonów metali, a następnie sekwencyjne oczyszczanie poprzez sonikację, wirowanie i mycie etanolem.

Protokół

UWAGA: Do przeprowadzenia eksperymentu należy używać rękawiczek lateksowych, okularów ochronnych i fartucha laboratoryjnego. Za każdym razem, gdy korzystasz z szafy bezpieczeństwa biologicznego, włącz wentylator szafki i utrzymuj drzwi szafy do połowy zamknięte.

1. Przygotowanie szklanych koralików

1. Umieść 100 szklanych koralików o średnicy 3 mm w butelce laboratoryjnej o pojemności 100 ml, a następnie szczelnie ją zakorkuj.
2. Zawartość należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 120 °C przez 10 min.
3. Pozostaw butelkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej, a następnie umieść ją w szafie bezpieczeństwa biologicznego.

2. Przygotowanie bulionu lizogennego (LB)

1. Rozpuść 8 g proszku bulionu LB-Lennox w butelce laboratoryjnej o pojemności 500 ml z 400 ml wody.
2. Mieszaj zawartość za pomocą mieszadła magnetycznego z PTFE (politetrafluoroetylenu) przez 20 minut, a następnie szczelnie przykryj.
3. Zawartość należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 120 °C przez 10 min.
4. Pozostaw roztwór do ostygnięcia do temperatury pokojowej i umieść go w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
5. Za pomocą pipety przelej bulion na osiem 15 ml probówek wirówkowych (po 12,5 ml każda) w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
6. Pozostałą ilość bulionu przelać do trzech butelek laboratoryjnych o pojemności 100 ml (każda po 100 ml) w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Szczelnie zakręć trzy butelki i przechowuj je w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

3. Kultura glonów Shewanella

1. Użyj głęboko zamrożonego szczepu kriokonserwowanego.
2. W komorze bezpieczeństwa biologicznego za pomocą szpatułki ze stali nierdzewnej pobrać 1 ml zamrożonego materiału z zamrożonej probówki i umieścić go w probówce wirówkowej przygotowanej w kroku 3.5.
3. Inkubować kultury przez 24 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C.

4. Przygotowanie szalek Petriego LB-Lennox (rosół z agarem)

1. Rozpuść dwie tabletki LB-Lennox (bulion z agarem) w 100 ml butelce laboratoryjnej ze 100 ml wody.
2. Mieszaj zawartość za pomocą mieszadła magnetycznego z PTFE przez 20 minut, a następnie szczelnie przykryj.
3. Zawartość należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 120 °C przez 10 min.
4. W komorze bezpieczeństwa biologicznego ręcznie rozatrakuj 100 ml roztworu na 4 szalki Petriego, upewniając się, że każda z nich otrzyma ~25 ml. Pozostaw roztwór do ostygnięcia do temperatury pokojowej.

5. Przygotowanie bakterii monoklonalnych

1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego oznacz trzy butelki przygotowane odpowiednio w kroku 2.6, #1, #2 i #3.
2. Odpipetować 0,1 ml powstałej zawiesiny bakteryjnej w kroku 3.3 do butelki #1. Zakręć butelkę i obracaj nią ręcznie przez 1 minutę, aby uzyskać jednorodny roztwór.
3. Odpipetować 0,1 ml powstałego płynu bakteryjnego w kroku 5.2 do butelki #2. Zakręć butelkę i obracaj nią ręcznie przez 1 minutę, aby uzyskać jednorodny roztwór.
4. Odpipetować 0,1 ml powstałego płynu bakteryjnego w kroku 5.3 do butelki #3. Zakręć butelkę i potrząsaj nią ręcznie przez 1 minutę, aby uzyskać jednorodny roztwór.
5. Odpipetować płyn z butelki #3 do 4 szalek Petriego przygotowanych w kroku 4.4, używając objętości 0,02 ml każda.
6. Umieść szklane koraliki przygotowane w kroku 1.3 do 4 używanych szalek Petriego, po 4 koraliki w każdym naczyniu.
7. Zamknij pokrywki szalek Petriego i potrząsaj nimi ręcznie przez 1 minutę.
8. Odwrócić szalki Petriego do góry nogami i inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 24 godziny.

6. Namnażanie bakterii monoklonalnych

1. Pobierz 7 probówek przygotowanych w kroku 2.5.
2. Za pomocą szpatułki ze stali nierdzewnej należy wybrać powstałe bakterie monoklonalne z 4 szalek Petriego przygotowanych w kroku 5.8 i umieścić je osobno w 7 probówkach.
3. Pozostawić 7 probówek w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 24 godziny.
4. Wybierz ten z największym rozproszeniem światła za pomocą wizualnej metody kolorymetrycznej.

7. Przygotowanie bulionu LB-Lennox z glukozą i solą

1. Wlej 10 g bulionu LB-Lennox, 10 g NaCl i 10 g glukozy do butelki laboratoryjnej o pojemności 500 ml. Dodaj wodę, aż objętość osiągnie 450 ml.
2. Mieszaj zawartość za pomocą mieszadła magnetycznego z PTFE przez 20 minut.
3. Zawartość należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 120 °C przez 10 min.

8. Przygotowanie wolframu sodu

1. Umieść 16,5 g wolframianu sodu Na₂WO_{4,2H 2}O w 100 ml butelce laboratoryjnej za pomocą szpatułki ze stali nierdzewnej. Dodaj wodę, aż objętość osiągnie 50 ml.
2. Mieszaj zawartość za pomocą mieszadła magnetycznego z PTFE przez 20 minut.
3. Zawartość należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 120 °C przez 10 min.
4. W komorze bezpieczeństwa biologicznego należy pobrać filtrat przez próżniowy filtr z włókna szklanego o porach 1 μm.

9. Przygotowanie LB z glukozą, solą i wolframianem sodu

1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego wlać ręcznie filtrat uzyskany w kroku 8.4 do roztworu z glukozą i solą przygotowanego w kroku 7.3.
2. W komorze bezpieczeństwa biologicznego porcjować pipetą 500 ml otrzymanego roztworu z kroku 9.1 do probówek wirówkowych o pojemności 10 x 50 ml.

10. Kultura bakterii

1. Do komory bezpieczeństwa biologicznego pobrać płyn przygotowany w kroku 6.4 i przelać go pipetą do 10 probówek przygotowanych w kroku 9.2, przy czym każda probówka otrzymuje 0,05 ml.
2. Inkubować 10 probówek w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 120 godzin.

11. Zbiór minerałów BME

1. Ultradźwięki każdej z 10 probówek w kroku 9.2 przy 20 kHz z mocą 150 W przez 1 godzinę.
2. Odwirować probówki o masie 2,025 x g przez 1 godzinę.
3. Usunąć klarowny płyn z probówek za pomocą pipety, dodać wodę, a następnie powtórzyć kroki 11.1 i 11.2 jeszcze raz.
4. Usunąć klarowną ciecz z probówek za pomocą pipety, dodać alkohol, a następnie ultrasonizować je przy 20 KHz z 150 W przez 1 godzinę.
5. Odwirować probówki o masie 2,025 x g przez 1 godzinę.
6. Powtórz kroki 11.4 i 11.5 jeszcze raz
7. Zbierz minerały BME, usuwając klarowny płyn z probówek za pomocą pipety; Następnie natychmiast zakryj probówki bez uruchamiania procesu suszenia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rosół LB(Lennox) z tabletkami agarowymi	Sigma-Aldrich	L7075	1 tabletka na 50 ml bulionu z agarem
Rosół LB (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	LB (Lennox) proszek 1 kg
Dekstroza bezwodna	Odczynnik Nihon Shiyaku	PL 78695	glukoza
Wolframian sodu	Odczynnik Nihon Shiyaku	PL 76050	Na2WO4 · 2H2O
Chlorek sodu	Odczynnik Nihon Shiyaku	PL 68131	Zawartość NaCl
Etanol 99,5%	Acros organiczny	AC615090040	CH3CH2OH
Woda	Wyprodukowano na naszej uczelni		Woda dejonizowana
Autoklaw	Tomin Medical Equipmenco, Ltd., Tajpej, Tajwan, Republika Chińska	TM-329 powiedział:	podgrzewać do 120 °C przez 10 min
Wirówka	System laboratoryjny systemu cyfrowego, Nowe Tajpej, Tajwan, ROC	DSC302SD	Wirówka przy 2025 x g
-80 °C Lodówka	Panasonic	MDF-U3386S	Służy do głębokiego zamrażania szczepu kriokonserwacyjnego
Homogenizator ultradźwiękowy Sonicator Procesor Zakłócacz komórek	Lenox	Zasilacz UPS-150	częstotliwość: 20 KHz, moc 150 W
Inkubator	Wykonane przez klienta	Wykonane na zamówienie	podgrzać do 40 °C lub schłodzić do 18 °C z kotrolem czasowym
Wzajemne kąpiele wstrząsowe	Kingtech Scientific Co., Sp. z o.o.	WBS-L
Cyfrowa płyta grzejna do mieszania	Corning	#6797-620D	używać z mieszadłem magnetycznym z PTFE
Szafa bezpieczeństwa biologicznego	Zong Yen co., Sp. z o.o.	ZYBH-420	Wszystkie procesy związane z bakteriami odbywają się tutaj
Probówka wirówkowa 50 ml	Sokół	14-432-22
Probówka wirówkowa 15 ml	Sokół	14-959-53A
Butelka laboratoryjna 100 ml	Duran	21 801 24 5
Butelka laboratoryjna 500 ml	Duran	21 801 44 5
Szpatułka ze stali nierdzewnej	Szkło chemiczne	CG-1981-10
Jednorazowe mieszadła z PTFE	Rybak	S68066 powiedział:
Plastikowe szalki Petriego	Rybak	S33580A
Algi Shewanella	Dzięki uprzejmości autora #3	Dzięki uprzejmości autora #3