Ocena wpływu pożytecznych bakterii na translokację mikrobiologiczną jelit u szczurów narażonych na stres cieplny

Streszczenie

Źródło: Sorokulova, I., et al. Zapobieganie niekorzystnym skutkom stresu cieplnego u szczurów przez szczep Bacillus subtilis . J. Vis. Exp. (2016)

Ten film przedstawia szczury wstępnie potraktowane pożytecznymi bakteriami lub solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i wystawione na stres cieplny w celu oceny integralności bariery jelitowej. Mniej kolonii bakteryjnych pochodzenia jelitowego z wątroby leczonych szczurów, w przeciwieństwie do licznych kolonii u szczurów kontrolnych, wskazuje na nienaruszoną barierę nabłonkową i minimalną translokację bakteryjną.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Projekt eksperymentalny

1. Leczenie zwierząt należy rozpocząć przez zgłębnik doustny po 2 dniach aklimatyzacji. Użyć strzykawki z doustną igłębnikiem. Leczyć 16 szczurów zawiesiną Bacillus subtilis BSB3 (1 ml na szczura) dwa razy dziennie przez dwa dni (grupa B. subtilis). Podaj 16 szczurom buforowaną fosforanami solą fizjologiczną, PBS (1 ml na szczura), dwa razy dziennie przez dwa dni (grupa PBS) (ryc. 1).
2. Po leczeniu podziel każdą grupę (8 szczurów na grupę): Grupa 1 - grupa kontrolna (PBS / bez stresu), grupa 2-B. subtilis (B. subtilis / bez stresu), grupa 3 - stres (PBS / stres cieplny) i grupa 4 - B. subtilis + stres (B. subtilis / stres cieplny).
3. Zmierz temperaturę w odbycie każdego szczura za pomocą elektronicznego termometru cyfrowego. Szczury z grup 1 i 2 należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez 25 minut. Umieścić zwierzęta z grup 3 i 4 w komorze klimatycznej o temperaturze 45 °C i wilgotności względnej 55% na 25 minut.
4. Następnie zmierz temperaturę w odbycie każdego szczura we wszystkich grupach za pomocą elektronicznego termometru cyfrowego. Umieść wszystkie zwierzęta w temperaturze pokojowej na 4 godziny.
5. Znieczulenie szczurów izofluranem (2 - 4%) w zamykanym słoiku do znieczulenia i obserwowanie, aż szczury zostaną głęboko znieczulone (brak reakcji na uszczypnięcie palca). Eutanazja szczurów przez szybkie ścięcie głowy za pomocą gilotyny.
6. Pobrać krew z tułowia od każdego szczura (15 - 16 ml) za pomocą pipet apirogennych do probówek apirogennych w celu uzyskania surowicy i natychmiast pobrać próbki krwi (7 μl od każdego szczura) za pomocą pipety do badania mikroskopowego.
7. Umieść probówki z krwią w lodówce na co najmniej 30 minut, aby umożliwić krzepnięcie. Odwirować probówki w temperaturze 20 °C, 7 000 x g przez 10 minut i szybko usunąć surowicę za pomocą pipety. Podwielokrotność surowicy otrzymanej od każdego szczura podzielić na objętości 50 μl i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu oznaczenia.

2. Zabieg chirurgiczny

1. Obetnij/przytnij całe futro z brzucha i klatki piersiowej od spodu tuszy za pomocą nożyc elektrycznych. Umieść tuszę w sterylnej szafce i potraktuj ogoloną powierzchnię tuszy 70% alkoholem.
2. Użyj sterylnego skalpela, aby wykonać nacięcie w linii środkowej brzucha. Usuń wątrobę, krezkowe węzły chłonne, śledzionę i jelito cienkie od każdego szczura za pomocą sterylnej pęsety.

3. Analiza translokacji bakteryjnej

1. Umieść każdą próbkę wątroby, krezkowych węzłów chłonnych i śledziony w wstępnie zważonych sterylnych probówkach i zważ. Obliczyć masę próbki jako różnicę między masą probówki z próbką a masą pustej probówki.
2. Dodać sterylny PBS do probówki, aby uzyskać rozcieńczenie 1:10 (waga na objętość, w/v) próbki i homogenizować każdą próbkę za pomocą sterylnego homogenizatora tkanek szklanych w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny.
3. Wykonać seryjne rozcieńczenia (^10-1 do ^10-4) każdej próbki w sterylnym PBS. Umieścić 0,1 ml wszystkich rozcieńczeń każdej tkanki na powierzchni MacConkey's i 5% agaru z krwią i agarem z krwią Brucella z heminą (0,005 g/l) i witaminą K1 (0,01 g/l).
4. Inkubować tlenowo płytki MacConkeya i 5% agar z krwią oraz płytki z agarem z krwią Brucella w warunkach beztlenowych w temperaturze 37 ^oC.
5. Policz kolonie bakterii tlenowych po 24 godzinach i kolonie bakterii beztlenowych po 48 godzinach inkubacji za pomocą licznika kolonii. Wyraź wyniki jako liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) w gramie tkanki.

Wyniki

Rysunek 1. Projekt badania. Dwie grupy szczurów (po 16 szczurów w każdej grupie) były leczone przez zgłębnik doustny z Bacillus subtilis BSB3 (grupa B. subtilis ) lub z PBS (grupa PBS) dwa razy dziennie. W dniu 3...

Materiały