Analiza żywotności Microcystis aeruginosa za pomocą cytometrii przepływowej

Streszczenie

Źródło: Chapman, I. J. i wsp., Optymalizacja sondy molekularnej w celu określenia śmiertelności komórek w organizmie fotosyntetyzującym (Microcystis aeruginosa) przy użyciu cytometrii przepływowej. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film przedstawia metodę rozróżniania żywych i martwych komórek Microcystis aeruginosa poprzez połączenie znakowania sondą fluorescencyjną z analizą autofluorescencji fikocyjaniny i sygnałem sondy za pomocą cytometrii przepływowej.

Protokół

1. Optymalizacja wychwytu komórek sondy molekularnej

1. Zbierz połowę kultury M. aeruginosa z fazy wykładniczej i użyj jej jako "żywej" kontroli.
   UWAGA: Próbki rozcieńczone z hodowli o dużej gęstości bezpośrednio do fazy wykładniczej mogą wpływać na wyniki optymalizacji poprzez obrót martwych komórek w porównaniu z kulturami zaszczepionymi z początkowej fazy opóźnienia/indukcji.
2. Przygotuj drugą połowę jako "martwą" kontrolę, stosując metody takie jak 70% etanol, podgrzewanie próbek w temperaturze 60 ^oC przez 1 godzinę, paraformaldehyd lub 4% formaldehyd przez 30 minut. Należy sprawdzić zmiany w mikrośrodowisku próbek (np. pH).
   UWAGA: Dodatnia, zabita termicznie, "martwa" kontrola u M. aeruginosa różni się od "żywej" próbki poprzez spadek sygnałów fikocyjaniny. Wywoływanie śmiertelności innymi metodami może nie powodować takiej samej wydajności i będzie się różnić w zależności od gatunku.
3. Skonfiguruj próbki mieszane, używając różnych proporcji próbek "żywych" i "martwych" (np. 0%, 25%, 50%, 100%).
4. Zdezagreguj tworzenie kolonii przez wirowanie lub sonikację i sprawdź pH.
5. Wybierz laser 488 nm wraz z detektorami, które mogą rejestrować fluorescencję z zielonych (kanał fluorescencji 1 lub FL1, 530 ± 15 nm) i pomarańczowych (kanał fluorescencji 2 lub FL2, 585 ± 20 nm) sond kwasów nukleinowych oraz laser 640 nm, aby rejestrować sygnały fikocyjaniny przez odpowiedni detektor.
   UWAGA: Po związaniu z DNA, zielona sonda kwasu nukleinowego ma przybliżoną długość fali wzbudzenia fluorescencji 504 nm i maksima emisji 523 nm, podczas gdy pomarańczowa sonda kwasu nukleinowego ma długość fali wzbudzenia 547 nm i maksima emisji 570 nm. Laser półprzewodnikowy z jonami argonu o długości 488 nm może być użyty do wzbudzenia obu sond molekularnych, jednak zielony laser (do 547 nm) wytworzy wyższą pomarańczową fluorescencję.
6. Jako punkt wyjścia należy wprowadzić sondę molekularną o stężeniu zalecanym przez producenta do 50% "żywych" i 50% "martwych" kultur i inkubować w ciemności.
7. Wybierz nową komórkę danych, umieść próbkę pod portem wprowadzania próbki (SIP) z progami i wyzwalaczami, które zmniejszą szum tła (FSC-H lub wysokość rozproszenia do przodu, 80 000).
8. Utwórz wykres gęstości z parametrami FSC-H i SSC-H (wysokość rozrzutu bocznego) oraz trzema histogramami. Jeden histogram wykorzystujący odpowiedni kanał detektora optycznego sondy molekularnej (FL1 lub 2), jeden do wykrywania emisji fikocyjaniny (wysokość kanału fluorescencji 4 lub FL4-H), a drugi, FSC-H, wszystkie w skali logarytmicznej.
9. Inkubować próbki M. aeruginosa z sondami kwasów nukleinowych w ciemności przez maksymalnie 60 minut, rejestrując w oddzielnych komórkach danych w różnych punktach czasowych (1, 5, 10, 15, 30 i 60 minut).
   UWAGA: Podczas regulacji parametrów, takich jak pH, należy skontaktować się z producentami pod kątem potencjalnych reakcji z niektórymi chemikaliami (w przypadku testowanych sond kwasów nukleinowych bufor nie może zawierać fosforanów ani wysokich poziomów kationów jednowartościowych lub dwuwartościowych, ponieważ wiązanie z DNA zostanie zmniejszone).
10. Zastosuj bramkę programową, aby uwzględnić tylko histogram FSC-H (320 000 - 1 500 000) dla wielkości komórki organizmu docelowego w odpowiednim histogramie kanału sondy fluorescencyjnej.
    UWAGA: Stężenia użyte w tym protokole wynosiły 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 i 100 μM, które można zmienić poprzez zwiększenie lub zmniejszenie objętości próbki M. aeruginosa lub początkowego roztworu podstawowego sond nukleinowych.
11. W kanale sondy fluorescencyjnej zastosuj kolejną włączoną bramkę programową do najwyższego piku na histogramie (zielony FL1-H, 240 000 - 1 650 000, pomarańczowy FL2-H, 30 000 - 165 000), a następnie zabramuj tę dodatnią fluorescencję sondy na wykresie gęstości.
12. Wykonaj kroki 3.1 - 3.11 ze 100% "żywymi", 100% "martwymi" próbkami i wszystkimi mieszanymi próbkami kultur, dostosowując stężenia sondy molekularnej (np. x 0,1 do x 10) i/lub temperaturę i poziomy pH, jeśli to konieczne.
13. Porównaj liczbę dodatnich sygnałów fluorescencyjnych sondy molekularnej z pierwotną gęstością komórek "martwych" komórek (pobranych z połowy całkowitego FSC-H lub 100% "martwej" hodowli), aby znaleźć całkowity procent komórek wybarwionych sondami kwasów nukleinowych.
14. Zrób to dla każdego okresu w każdym stężeniu, aby znaleźć optymalny protokół dla najwyższego procentu wychwytu sondy jądrowej komórki bez wytwarzania niespecyficznego barwienia (użyj średnich z jednokierunkowej analizy wariancji, ANOVA lub jednokierunkowej analizy wariancji Kruskala-Wallisa, jeśli dane są nieparametryczne).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sinice Media	Sigma-Aldrich	C3061-500ML	BG-11 Stężony roztwór słodkowodny (rozcieńczenie x50)
Płyn do dekontaminacji	BD Nauki biologiczne	653155	Działa przez 2 minuty, gdy wydajność jest większa niż 12 zdarzeń na sekundę w trybie szybkim lub przy natężeniu przepływu 66 μl/min. Następnie 2 minuty osłony H2O.
Cytometr przepływowy	BD Nauki biologiczne	na żądanie	BD Accuri C6
SYTOX Zielony	Technologie życiowe	Zobacz materiał S7020	Barwienie kwasem nukleinowym – 5 mM roztwór w DMSO
SYTOX Pomarańczowy	Technologie życiowe	Zobacz materiał S11368	Barwienie kwasem nukleinowym – 5 mM roztwór w DMSO