Ocena aktywności przeciwdrobnoustrojowej wariantów nizyny przy użyciu testu dyfuzji w studzience agarowej

Streszczenie

Źródło: Nickling, J. H., et.al. Peptydy przeciwdrobnoustrojowe wytwarzane przez selektywne wprowadzanie aminokwasów niekanonicznych pod ciśnieniem. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film przedstawia test dyfuzji w studzience agarowej stosowany do oceny aktywności przeciwdrobnoustrojowej wariantów nizyny. Pokazuje, w jaki sposób Lactococcus lactis wyrażający związaną z błoną peptydazę NisP aktywuje prekursory nizyny wytwarzane w E. coli, powodując zahamowanie wzrostu. Rozmiar tych aureoli odzwierciedla bioaktywność każdego wariantu nizyny.

Protokół

1. Test aktywności przeciwdrobnoustrojowej

1. Przygotowanie płytek agarowych GM17 w sterylnych warunkach
   1. Przygotować całonocną hodowlę szczepu wskaźnikowego L. lactis NZ9000 przenoszącego plazmid pNG nisPT w temperaturze 30 °C w bulionie M17 z 1% (w/v) glukozy (=GM17) i 5 μg/ml chloramfenikolu.
   2. Zmierzyć OD₆₀₀, zaszczepić świeżą pożywkę do OD₆₀₀ = 0,1 i inkubować do OD₆₀₀ = 0,4-0,6. Następnie umieść kolbę na lodzie.
      NUTA: Każdy pomiar OD₆₀₀ zużyje objętość kultury. Należy pamiętać, że dla każdej płytki agarowej do testu potrzebna będzie 1 ml kultury bakteryjnej. W razie potrzeby odpowiednio zwiększ objętość płynnej kultury.
   3. W przypadku agaru 1,5% odważ 4,5 g agaru w szklanej butelce z podłożem. Dodaj 300 ml ddH₂O, wymieszaj i autoklaw.
   4. Przygotuj 2x bulion M17 (dwukrotnie zagęszczony) w 300 ml ddH₂O i autoklawu.
   5. Zmieszaj 25 ml bulionu 2x M17 zawierającego 10 μg/ml chloramfenikolu i 2% glukozy z 1 ml prekultury L. lactis (4% v/v).
   6. Dodaj 25 ml stopionego 1,5% agaru (świeżo autoklawizowanego lub podgrzanego w kuchence mikrofalowej).
      NUTA: Wcześniej pozwól butelce ostygnąć w dotyku (około 50 °C). Jest to konieczne, ponieważ L. lactis jest organizmem mezofilnym wrażliwym na wysokie temperatury.
   7. Wlej roztwór do dużej szalki Petriego. Suszyć talerze przez 10-15 min.
   8. Wysterylizuj końce szklanej pipety Pasteura na płomieniu. Poczekaj, aż ostygnie, a następnie użyj szerokiego końca, aby zrobić otwory w zestalonym agarze GM17.
2. Przygotowanie próbki
   1. Pobrać 1 ml kultur ekspresyjnych E. coli w znakowanej probówce o pojemności 1,5 ml i odwirować przez 3 minuty przy 7 000 x g. Odessać pozostałą pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 μl Na-P (50 mM bufor fosforanu sodu, pH 7,4 wykonany z 0,5 M diwodorofosforanu sodu i 0,5 M wodorofosforanu disodowego).
   2. Sonikować próbki na lodzie. Zanurz końcówkę sondy sonikatora w zawiesinie ogniwa. Ustaw sonikator na amplitudę 30 % z impulsem 1 s włączonym i 5 s wyłączonym na 3 min.
   3. Odwirować lizat komórkowy przez 10 minut przy 13 000 x g, aby rozdrobnić resztki komórek. Przenieść supernatant do nowej probówki reakcyjnej na lodzie.
   4. Rozcieńczyć i znormalizować supernatanty ekstraktu komórkowego do 1 ml OD₆₀₀ = 0,6, w stosunku do gęstości zebranych komórek, za pomocą Na-P.
3. Test aktywności
   1. Dodać 40 μl każdej znormalizowanej próbki do otworu w płytce wskaźnikowej ( rysunek 1). Stosować chloramfenikol w stężeniu 400 μg/ml jako przeciwbakteryjny związek kontrolny. Użyć buforu elucyjnego jako kontroli ujemnej. Poczekaj, aż wszystkie próbki zostaną rozproszone w agarze . Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 30 °C.
   2. Zrób zdjęcia płytek agarowych za pomocą skanera płaskiego lub aparatu cyfrowego. Rozmiary halo zahamowania wzrostu można mierzyć ręcznie lub za pomocą ImageJ.

Wyniki

Rysunek 1. Test aktywności przeciwdrobnoustrojowej lizatów komórkowych zawierających warianty nizyny wytwarzane za pomocą SPI z analogami proliny. Porównanie wariantów nizyny z rekombinowanymi próbkami t...

Materiały