Kwantyfikacja jednostek tworzących kolonie bakterii związanych z jelitami u much Drosophila

Streszczenie

Źródło: Dodge, R., et al. Szybkie liczenie jednostek tworzących kolonie w formacie 96-dołkowej płytki zastosowanej do mikrobiomu Drosophila . J. Vis. Exp. (2023)

Ten film pokazuje ilościowe oznaczanie jednostek tworzących kolonie (CFU) bakterii związanych z jelitami u much Drosophila przy użyciu podejścia opartego na seryjnym rozcieńczaniu i posiewaniu. Homogenizowane próbki much zawierające bakterie jelitowe są seryjnie rozcieńczane, posiewane na agarze i inkubowane, aby umożliwić wzrost kolonii. Obrazy płytek są następnie analizowane za pomocą oprogramowania w celu wyrównania, segmentacji i zliczenia kolonii w każdym miejscu, co umożliwia dokładne określenie ilościowe CFU.

Protokół

1. Homogenizacja much pojedynczo na 96-dołkowej płytce PCR

1. Przygotuj wcześniej talerze do ubijania koralików.
   1. Wlej szklane kulki o wielkości 0,5 μm (patrz tabela materiałów) na tackę do pomiaru kulek. Rozłóż koraliki na tacy, aby wszystkie dołki były pełne i równe, a następnie zetrzyj nadmiar koralików do stożkowej tuby, aby je odzyskać.
   2. Umieść płytkę z półspódniczką reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) (patrz Tabela materiałów) do góry nogami na tacy pomiarowej i wyrównaj ją z dołkami, dopasowując ją do wgłębienia na tacy. Następnie szybko odwróć go, aby przenieść koraliki.
   3. Usuń nadmiar koralików z powierzchni płytki PCR i przykryj ją folią. Sprawdź płytkę PCR, aby upewnić się, że wszystkie studzienki zawierają koraliki. W razie potrzeby użyj miarki do ważenia, aby dodać koraliki do jednego dołka. Jeśli elektryczność statyczna powoduje przywieranie kulek do powierzchni płytki, przetrzyj lub spryskaj tylną część tacki pomiarowej i płytki PCR 70% etanolem.
   4. Przykryj folią aluminiową. W ten sposób można przygotować wiele płytek, a następnie sterylizować w autoklawie i przechowywać do późniejszego wykorzystania. Gdy produkt jest gotowy do użycia, dodać 100 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do każdej studzienki za pomocą pipety 96-kanałowej (patrz tabela materiałów).
2. Przed homogenizacją wysterylizuj powierzchniowo muchy skolonizowane przez drobnoustroje za pomocą 70% etanolu.
   1. Znieczulaj muchy 100% CO₂ przez 5 s. Przenieść znieczulone muchy z fiolki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml za pomocą małego lejka (ryc. 1A-2). W tym badaniu zwykle dodawano 25 much na rurkę.
   2. Natychmiast rozpyl ~1 ml 70% etanolu do probówki, zamknij probówkę i mieszaj przez odwrócenie przez 10 sekund. Następnie odessaj etanol za pomocą pipety P1000, uważając, aby nie zassać żadnych much. Powtórzyć ponownie z etanolem, a następnie dwa razy ze sterylnym PBS (ryc. 1A-3).
3. Po ostatnim umyciu PBS zamknij rurkę i nakrętką skierowaną w dół postukaj nią kilka razy mocno w ławkę, aby muchy weszły do nasadki.
4. Otwórz probówkę i wlej muchy do studzienek za pomocą kleszczy (ryc. 1A-4). Umieść po jednej muchy w każdej studzience (Rysunek 1A-5). Podczas ładowania trzymaj talerz na lodzie, aby muchy były znieczulone.
5. Uszczelnij płytę za pomocą folii termozgrzewalnej Thermal Bond (patrz Tabela materiałów).
   1. Najpierw usuń wszelkie zabłąkane koraliki, które znajdują się w pobliżu studzienek, ponieważ mogą one spowodować wyciek z uszczelki foliowej. Upewnij się, że matowa strona folii jest skierowana w dół na płycie, a błyszcząca strona do góry w kierunku zgrzewarki. Mocno dociśnij zgrzewarkę (patrz Tabela materiałów) przez 5 sekund (Rysunek 1A-6). Polerowanie za pomocą aplikatora ręcznego (patrz Tabela materiałów), aby zabezpieczyć folię.
      UWAGA: Słabe uszczelnienie jest przyczyną utraty próbki.
6. Zabezpiecz płytkę w wytrząsarce do płyt. Homogenizować przez 5 minut (Rysunek 1A-7). Obracaj płytkę stopki przez 30 s w mini-wirówce do płytek (patrz tabela materiałów) na poziomie 350 x g , aby usunąć płyn z folii uszczelniającej.
7. Usuń folię, trzymając płytkę, aby nie rozpryskiwać kropelek homogenatu muchowego z dołków.

2. Seryjne rozcieńczanie homogenatu muchowego i plamienie na płytkach CFU

1. Umieść cztery prostokątne płytki do wzrostu agaru de Mana, Rogosy i Sharpe'a (MRS) (patrz tabela materiałów) w komorze bezpieczeństwa biologicznego i zdejmij ich pokrywki. W tym protokole agar MRS został użyty do wzrostu L. plantarum. Pozostaw te talerze do wyschnięcia na co najmniej 10 minut (20 minut, jeśli są świeżo wylane lub schłodzone z przechowywania).
   UWAGA: Jeśli płytki są mokre, kropelki z płytki 96-dołkowej spłyną razem i zrujnują liczenia.
2. Przygotować trzy płytki rozcieńczające, dodając 100 μl PBS do każdego dołka sterylnej płytki 96-dołkowej za pomocą pipetora 96-kanałowego. Załaduj stojak z końcówkami P20 do 96-kanałowego pipetora.
3. Wykonać rozcieńczenie w stosunku 1:10 przez zasysanie 11,1 μl homogenatu z płytki z próbką przygotowaną w sekcji 1 (rysunek 1A-8). Pamiętaj, aby rysować od środka studzienek, a nie od dna studzienek, ponieważ homogenat muchy i szklane kulki zatkają pipety. Koraliki toną, a cząstki much unoszą się na wodzie, pozostawiając środkową warstwę w większości przezroczystą.
4. Dozować 11,1 μl do pierwszej płytki rozcieńczającej, która zawiera już 100 μl sterylnego PBS na studzienkę. Trzymać płytkę rozcieńczającą na wytrząsarce płytek przez 10 s przy 600 obrotach na minutę (obr./min). Wymieszać ponownie, pipetując w górę i w dół przez pięć cykli. Przenieść 11,1 μl z pierwszej płytki rozcieńczającej na drugą płytkę rozcieńczającą i powtórzyć etapy mieszania dla dwóch następnych płytek rozcieńczających.
5. Wykonać posiewy seryjne z rozcieńczeniami, jak opisano poniżej.
   1. Wyjmij płytki wzrostowe z szafy bezpieczeństwa biologicznego.
   2. Zaczynając od najbardziej rozcieńczonej płytki, naniec 2 μl z każdej studzienki na płytki agarowe za pomocą pipetora 96-dołkowego (Rysunek 1A-9).
      1. Powoli opuść głowicę pipety na płytkę, uważając, aby nie wbić się w agar. Dokładnie sprawdź płytkę i upewnij się, że wszystkie plamki zostały dozowane; jeśli nie, ręcznie dodaj 2 μl w odpowiednie miejsce. Sprawdź, czy plamy płynu szybko wsiąkają w agar i nie spływają razem.
      2. Jeśli plamy biegną razem, wysusz nowy zestaw świeżych płytek agarowych przez dłuższy czas i powtórz plamienie. Jeśli istnieje wiele rodzajów płytek (np. z różnymi podłożami lub z antybiotykami), należy je również wykryć. Pozostały roztwór należy odlać z powrotem do płytki rozcieńczającej i przejść do następnego wyższego stężenia.
         UWAGA: W przypadku rozcieńczania punktowego, następne rozcieńczenie należy wymieszać pięć razy, aby upewnić się, że zawartość końcówek pipet została oczyszczona z poprzedniego rozcieńczenia. Płytki rozcieńczające można przechowywać przez >8 godzin w temperaturze 4 °C bez wpływu na liczbę kolonii.
6. Powtórzyć proces powlekania zgodnie z opisem w kroku 2.5 dla pozostałych płytek rozcieńczających, przechodząc od najbardziej rozcieńczonej do najbardziej skoncentrowanej, aż do płytki z oryginalnym homogenatem.
7. Gdy cały płyn zostanie wchłonięty przez agar, odwróć płytki i umieść je w inkubatorze (Rysunek 1A-10). Dla Lactiplantibacillus i Acetobacter z Drosophila optymalna temperatura wynosi 30 °C na pożywkach MRS. Inkubuj, aż kolonie osiągną optymalną wielkość: kolonie są wystarczająco duże, aby je wyraźnie zobaczyć, ale nie na tyle duże, aby łączyły się lub przeszkadzały sobie nawzajem we wzroście (patrz reprezentatywne wyniki w celu ilościowego określenia optymalnej wielkości).
   UWAGA: Optymalne warunki wzrostu są zależne od szczepu i muszą być określone empirycznie. Dla Lactiplantibacillus z Drosophila optymalny czas inkubacji wynosi od 26 h do 30 h na agarze MRS. W przypadku Acetobacter z Drosophila optymalny czas inkubacji wynosi od 30 h do 48 h na MRS, w zależności od szczepu.
8. Po inkubacji, w razie potrzeby, przechowywać płytki w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą gotowe do liczenia.

3. Kwantyfikacja jednostek tworzących kolonie (CFU)

1. Określ ilościowo CFU, fotografując płytki, a następnie licząc kolonie za pomocą zautomatyzowanego oprogramowania, jak opisano poniżej. Jeśli płytki były przechowywane w temperaturze 4 °C, najpierw pozwól im osiągnąć temperaturę pokojową, aby nie doszło do kondensacji na płytach, która powoduje odblaski.
2. Uporządkuj płyty w logicznej kolejności i utrzymuj je w tej kolejności podczas fotografowania — ułatwia to nazywanie plików. Ustaw wszystkie płytki tak, aby komórka A1 znajdowała się w lewym górnym rogu wszystkich płyt. Zaleca się oznaczenie narożnika A1 unikalnym identyfikatorem, aby upewnić się, że zdjęcia nie zostaną pomylone. Ułóż każdą serię rozcieńczeń w kolejności.
3. Zdejmij pokrywę talerza i umieść talerz na stoliku z A1 zorientowanym we właściwym rogu. Pudełko na zdjęcia płyt jest zoptymalizowane pod kątem fotografowania tych tac i zawiera opcje oświetlenia i filtrów do obrazowania kolonii fluorescencyjnych.
4. Wyobraź sobie płyty. Użyj aparatu (patrz Tabela materiałów) z ustawieniami ręcznymi, aby uzyskać stały poziom ekspozycji między płytami. Zalecane jest ustawienie długiej ogniskowej, aby zminimalizować zniekształcenia perspektywy. Zrób zdjęcie za pomocą zdalnej migawki, aby zminimalizować rozmycie spowodowane drganiami aparatu.
5. Przenieś obrazy do komputera i zmień ich nazwy, w tym nazwę eksperymentu, rodzaj podłoża, współczynnik rozcieńczenia i wszelkie inne istotne szczegóły. Niektóre systemy operacyjne (patrz Spis materiałów) mają przydatną funkcję zmiany nazw wsadowych w Finderze poprzez kliknięcie prawym przyciskiem myszy wybranych plików.

4. Automatyczne zliczanie kolonii za pomocą pakietu Count-On-It

1. Przytnij obrazy za pomocą dostarczonej wtyczki Croptacular dla ImageJ. Ta wtyczka pomaga podzielić obraz na uporządkowaną tablicę podregionów (np. 8 x 12 dla płytki 96-dołkowej). Podregiony będą liczone indywidualnie.
   1. Uporządkuj obrazy do przetworzenia w celu oceny ilościowej w folderze. Wybierz nazwy plików, które odróżniają płyty, ponieważ te nazwy plików stają się tytułami kolumn dla każdego zestawu zliczeń. W tym folderze utwórz podfoldery o nazwach "przycięte" i "paragony".
   2. Uruchom Croptacular i kliknij OK , aby rozpocząć przycinanie.
      UWAGA: Wyświetlane są ustawienia domyślne, które zazwyczaj są wystarczające. W zależności od rozdzielczości obrazu, oświetlenia, rozmiaru plamki itp., pomocne może być dostosowanie parametrów bazowych.
   3. Jeśli obraz jest już prosty, po prostu naciśnij spację. W przeciwnym razie wyprostuj obraz, rysując linię wzdłuż krawędzi, która powinna stać się pozioma. Przerysuj linię tyle razy, ile to konieczne, jeśli obraz nadal nie wygląda na wyprostowany.
   4. Następnie narysuj pole graniczne obszaru, dla którego ma zostać wykonane liczenie. Dostosuj rozmiar i proporcje, aż wszystkie plamki znajdą się w swoich komórkach. Przeciągnij kursor poza obwiednię, aby odświeżyć siatkę. Gdy siatka wygląda dobrze, naciśnij Spacja.
   5. Upewnij się, że następny obraz zostanie automatycznie obrócony pod tym samym kątem, co pierwszy; Wtyczka zakłada, że wszystkie zdjęcia są wyrównane tak samo. Jeśli to prawda, naciśnij spację , aby kontynuować. W przeciwnym razie wyprostuj obraz jak poprzednio. Siatka również przywołuje tę samą pozycję, co na poprzednim obrazie; W razie potrzeby dostosuj, a następnie naciśnij Spacja.
2. Wylicz kolonie na płytkach za pomocą dostarczonej wtyczki Count-On-It: Gridiron dla ImageJ.
   1. Uruchom Count-On-It > Gridiron. Użyj tych samych ustawień siatki, co w przypadku Croptacular. Użytkownicy mogą grupować cały folder, analizować pojedynczy obraz lub zaczynać od bieżącego obrazu.
   2. Ustaw próg na podstawie górnej i dolnej wartości intensywności pikseli. Ustaw próg tak rygorystycznie, jak to możliwe, jednocześnie wybierając wszystkie kolonie. Idealnie byłoby, gdyby między wybranymi koloniami była pewna przestrzeń, ale oprogramowanie jest w stanie do pewnego stopnia segmentować plamy. Kliknij przycisk OK w oknie dialogowym "Wymagane działanie", gdy próg jest zadowalający.
   3. Aby sprawdzić wyniki, powiększ i przyjrzyj się dokładniej liczbie kolonii. Kliknięcie przycisku Anuluj spowoduje przerwanie działania wtyczki. Kliknij przycisk OK , aby kontynuować.
   4. Na pierwszym obrazie upewnij się, że dostępna jest opcja kontynuowania lub powrotu do menu ustawień, na przykład w celu zmiany minimalnego rozmiaru kolonii. Aby kontynuować proces wsadowy, kliknij przycisk OK. Następnie wybierz folder, w którym chcesz przechowywać tabelę paragonów i wyników. Użyj folderu "paragony" lub utwórz nowy folder.
   5. Po pierwszym obrazie następne obrazy będą domyślnie ustawione na ten sam próg, co poprzednie ustawienia. Kliknij przycisk OK , aby użyć tych ustawień lub je dostosować. Jeśli zdjęcia są spójne, a ustawienie jest dokładne, kliknij przycisk OK w oknie dialogowym "Wymagane działanie".
      UWAGA: Gdy wszystkie obrazy w partii zostaną ukończone, tabela wyników zostanie automatycznie zapisana w tym samym folderze, co paragony.
   6. Przejrzyj paragony inwentaryzacyjne generowane przez oprogramowanie i ręcznie skoryguj wszelkie błędy liczenia. Wtyczka ImageJ jest statystycznie dokładna, ale zdarzają się błędy. Sprawdzaj paragony, aby badać wartości odstające i identyfikować błędy w liczeniu. Oprogramowanie zapisuje dane CFU jako plik .csv w tym samym folderze, w którym znajdują się paragony.
3. Analizuj dane za pomocą preferowanego przez użytkownika oprogramowania.

Wyniki

Rysunek 1: Test kolonizacyjny mierzy CFU w setkach pojedynczych muszek przy użyciu 96-dołkowej płytki. (A) Obrazowy przegląd zastosowanego testu kolonizacji i wysokoprzepustowej metody kwantyfikacji, zgodnie z opisem w sekcji ...

Materiały