Leczenie bakterii wysiękami z korzeni roślin w celu naśladowania interakcji roślina-mikroorganizm in vitro

Streszczenie

Źródło: Yi, Y., et al. Interakcja roślina-mikroorganizm: odpowiedź transkrypcyjna Bacillus mycoides na wysięki z korzeni ziemniaka. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film przedstawia przygotowanie i leczenie kultur Bacillus mycoides w celu zbadania interakcji między roślinami a mikroorganizmami. Przedstawia kroki od smugowania kultury podstawowej i inkubacji jej w płynnym podłożu do wystawienia bakterii na wysięk z korzeni roślin pod wpływem mieszania. Punktem kulminacyjnym procesu jest zebranie i błyskawiczne zamrożenie komórek bakteryjnych w celu późniejszej analizy zmian ekspresji genów wywołanych przez wysięki.

Protokół

1. Rozwój bakterii

1. Odcedzić B. mycoides z wywaru glicerolu o temperaturze -80 °C na płytkę agarową Luria-Bertani (LB) i inkubować płytkę w temperaturze 30 °C przez noc.

2. Zaszczepić płynną pożywkę LB pojedynczą kolonią z płytki i wyhodować kulturę w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 200 obr./min przez noc w temperaturze
30 °C.

2. Leczenie i pobieranie próbek bakterii

1. Aby porównać krzywą wzrostu bakterii traktowanych wysiękami korzeniowymi z kontrolą ujemną, należy przygotować serię kolb zawierających 50 ml płynnego podłoża LB. Dodać 0,5 ml nocnej kultury bakteryjnej do wszystkich kolb i dodać odpowiednio 0%, 5%, 10% lub 15% (v/v) wysięk z korzeni lub sterylną wodę dejonizowaną do pożywki.

2. Użyj kultury z wodą dejonizowaną zamiast wysięków korzeniowych jako kontroli. Następnie mierzyć gęstość optyczną przy 600 nm (OD₆₀₀) co 1 godzinę. Wygeneruj krzywą wzrostu, wykreślając wartości OD₆₀₀ w funkcji czasu.

3. Rozcieńczyć nocną kulturę B. mycoides 90 ml wstępnie podgrzanej pożywki LB do początkowego OD₆₀₀ ~ 0,05 w kolbie o pojemności 300 ml. Dodać 10 ml wysięku korzeniowego do kultury i inkubować w temperaturze 30 °C przez 1 godzinę.

4. Użyj 10 ml sterylnej wody dejonizowanej jako kontroli. Zebrać komórki z hodowli przez odwirowanie w temperaturze 9 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i natychmiast zamrozić osad w ciekłym azocie, a następnie przechowywać go w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Podchloryn sodu	Sigma	CAS: 7681-52-9	10-15% aktywny chlor
Rosół Luria-Bertani (LB)
Inkubator	Naukowy Nowy Brunszwik	Innova 4000
Spektrofotometr	Thermo Fisher Naukowy	Genesys 20 powiedział:
Ciekły azot
Koraliki szklane	Sigma	Klasa dystrybucji G8893	0,5 μm
Tubka 2,0 ml z nakrętką			Nie zawiera RNaz
Probówka Eppendorfa 1,5 ml i 2,0 ml			Nie zawiera RNaz
Wirówka	Eppendorf powiedział:	5430