Test wzrostu bakterii z ograniczoną ilością metali w celu zbadania roli genów reagujących na metale

Streszczenie

Źródło: Maurakis, S., et al. Ograniczony metalem wzrost Neisseria gonorrhoeae w celu scharakteryzowania genów reagujących na metale i pozyskiwania metali z ligandów gospodarza. J. Vis. Exp. (2020).

Ten film przedstawia test wzrostu bakterii z ograniczoną ilością metalu w celu zbadania roli genów reagujących na metale. Dzikie i zmutowane bakterie hodowane w pożywce zubożonej w metale są inkubowane z metalem-ligandem, a ich wzrost jest monitorowany za pomocą czytnika płytek. W warunkach zubożenia w metal, bakterie typu dzikiego wyrażają receptor powierzchniowy, który umożliwia pobieranie i wzrost metalu, podczas gdy mutant nie ma tego receptora, co powoduje ograniczony wzrost.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów podstawowych z zdefiniowanym podłożem (CDM) poddanych działaniu cheleksu

1. Roztwór podstawowy I
   1. Połączyć chlorek sodu lub NaCl(233,8 g), siarczan potasu lub_K2SO4 (40,0 g), chlorek amonu lub NH 4 Cl (8,8 g), wodorofosforan dipotasu lub_K2HPO4 (13,9 g) i diwodorofosforan monopotasowy lub KH₂PO₄ (10,9 g) w wodzie dejonizowanej do końcowej objętości 1 l.
   2. Przefiltrować i wysterylizować roztwór i poddzielić go do stożkowych probówek o pojemności 50 ml.
   3. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
2. Roztwór podstawowy II
   1. Połączyć kwas solny tiaminy lub HCl (0,2 g), pirofosforan tiaminy-Cl (0,05 g), pantotenian wapnia (0,19 g) i biotynę (0,3 g) w 50% (obj./obj.) etanolu do końcowej objętości 1 l.
   2. Rozlać do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.
3. Roztwór podstawowy III
   1. Połączenie L-asparaginianu (4,0 g), L-glutaminianu (10,4 g), L-argininy (1,2 g), glicyny (0,2 g), L-seryny (0,4 g), L-leucyny (0,72 g), L-izoleucyny (0,24 g), L-waliny (0,48 g), L-tyrozyny (0,56 g), L-proliny (0,4 g), L-tryptofanu (0,64 g), L-treoniny (0,4 g), L-fenyloalaniny (0,2 g), L-asparaginy-H₂O (0,2 g), L-glutaminy (0,4 g), L-histydyny-HCl (0,2 g), L-metioniny (0,12 g), L-alaniny (0,8 g), L-lizyna (0,4 g) i zredukowany glutation (0,36 g) w 500 ml wody dejonizowanej.
   2. Rozpuścić L-cysteinę (0,44 g) i L-cystynę (0,28 g) w minimalnej objętości (~1 ml) 1 M HCl i dodać do powyższego roztworu aminokwasów.
   3. Dostosować pH roztworu za pomocą 10 N wodorotlenku sodu (NaOH) aż do rozpuszczenia wszystkich cząstek stałych. Końcowe pH wyniesie 10,0–11,0.
   4. Doprowadzić ostateczną objętość do 1 l wodą dejonizowaną.
   5. Przefiltrować i wysterylizować roztwór i podzielić na 250 ml objętości.
   6. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
4. Roztwór podstawowy IV
   1. Glukozę (200 g) rozpuścić w wodzie dejonizowanej do końcowej objętości 1 l.
      UWAGA: Może być konieczne podgrzanie roztworu w celu rozpuszczenia glukozy.
   2. Przefiltrować-wysterylizować i podzielić roztwór na stożkowe probówki o pojemności 50 ml.
   3. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
5. Roztwór podstawowy V
   1. Połączyć hipoksantynę (5,0 g), uracyl (5,0 g) i NaOH (4,0 g) w wodzie dejonizowanej do końcowej objętości 1 l.
   2. Przefiltrować, wysterylizować i podsycić do stożkowych probówek o pojemności 50 ml.
   3. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
6. Rozwiązanie VI
   1. Przygotować 1 M dwuwodny roztwór chlorku wapnia lub CaCl_{2-2H 2}O (147 g/l) w wodzie dejonizowanej. Filtrować, sterylizować i przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).
7. Roztwór podstawowy VII
   1. Przygotować 1 M bezwodny roztwór siarczanu magnezu (_MgSO4) w wodzie dejonizowanej. Filtruj, sterylizuj i przechowuj w RT.
8. Roztwór podstawowy VIII
   1. Przygotować 1 M roztwór wodorowęglanu sodu (_NaHCO3) w wodzie dejonizowanej. Filtruj, sterylizuj i przechowuj w RT.

2. Przygotowanie 4x sterylnego koncentratu i 1x CDM

UWAGA: Procedurę tę należy wykonywać w sterylnym szkle poddanym działaniu kwasu lub w plastiku, aby zapobiec wypłukiwaniu metali do roztworów.

1. Połączyć roztwory podstawowe I (50 ml), II (20 ml), III (250 ml), IV (50 ml) i V (20 ml) z 20,0 g kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) i wymieszać.
2. Dostosuj pH do 7,4, a następnie doprowadź końcową objętość do 500 ml za pomocą wody dejonizowanej.
3. Umyj żywicę Chelex-100 w 1 litrze wody dejonizowanej, aby usunąć konserwanty przed dodaniem jej do 4x sterylnego koncentratu. W tym celu należy dodać 50 g żywicy do 1 l wody dejonizowanej i mieszać przez co najmniej 1 godzinę. Usuń wodę przez filtrację próżniową i użyj tej umytej żywicy w kroku 2.4.
4. Dodaj 50 g żywicy i powoli mieszaj dokładnie przez 90 minut.
5. Usunąć żywicę przez sterylizację filtra i przechowywać 4x sterylny koncentrat w temperaturze 4 °C.
6. Aby przygotować 1x stężenie robocze CDM, najpierw rozcieńczyć 4x koncentrat sterylną wodą dejonizowaną, następnie dodać roztwór VI (125 μL na 500 ml 1x roztworu), roztwór VII (535 μL na 500 ml) i roztwór VIII (10 ml na 500 ml).
   UWAGA: Chociaż wszystkie roztwory podstawowe zostały już wysterylizowane, zaleca się ponowną sterylizację filtracyjną roztworu 1x po przygotowaniu.

3. Przygotowanie płyt CDM

UWAGA: Z poniższego przepisu daje się 1 L podłoża na talerze, ale najlepiej przygotować je w mniejszych objętościach. Wszystko skaluje się proporcjonalnie w dół.

1. Agaroza myta
   1. Rozpuść 50 g agarozy w 1 l wody dejonizowanej, mieszając przez 1 godzinę.
   2. Przenieść roztwór do butelki wirówkowej i odwirować przy stężeniu 1 200 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie odlewać sklarowany osad i wyrzucić.
   3. Dodać wystarczającą ilość wody dejonizowanej, aby ponownie zawiesić osad agarozy, a następnie przenieść do kolby o pojemności 1 l. Doprowadzić do końcowej objętości 1 l wodą dejonizowaną, a następnie wymieszać i odwirować jak w kroku 3.1.2. Odrzucić supernatant.
   4. Dodać wystarczającą ilość 100% etanolu, aby ponownie zawiesić osad, a następnie przenieść do nowej kolby o pojemności 1 l. Doprowadzić do końcowej objętości 1 l za pomocą etanolu. Wymieszać i odwirować jak w kroku 3.1.2.
   5. Powtórz krok 3.1.4.
   6. Dodać metanol do granulki agarozy w celu ponownego zawieszenia, a następnie przenieść do kolby o pojemności 1 l. Doprowadzić do końcowej objętości 1 l za pomocą metanolu. Wymieszać i odwirować jak w kroku 3.1.2.
   7. Powtórz krok 3.1.6.
   8. Umytą agarozę przełożyć na tackę wyłożoną folią aluminiową i pozostawić do wyschnięcia w dygestorium. Po wyschnięciu przenieś do pojemnika bez metalu w celu długotrwałego przechowywania.
2. Do 750 ml wody dejonizowanej dodać 10 g umytej agarozy i 5 g skrobi ziemniaczanej.
3. Autoklaw przez 30 min w temperaturze 121 °C, 100 kPa powyżej ciśnienia atmosferycznego.
4. Pozostawić pożywkę do ostygnięcia do ~65 °C, a następnie dodać 250 ml 4X CDM, 250 μl roztworu VI, 1,07 ml roztworu VII i 20 ml roztworu VIII.
5. W razie potrzeby dodaj wybrane metale przed wylaniem talerzy. Dodanie chelatorów nie jest konieczne do utrzymania warunków wolnych od metali.
6. Wlać do szalek Petriego i pozostawić do zestalenia.

4. Metal ograniczony wzrost Neisseria gonorrhoeae

UWAGA: W przypadku większości zastosowań nie jest konieczne obciążanie bakterii metalem przed inokulacją CDM. Początkowy etap podwojenia CDM i następujące po nim rozcieńczenie są wystarczające do wyczerpania gonokoków w ich wewnętrznych zapasach żelaza i. W związku z tym pierwsze dwa etapy poniższej procedury przeprowadza się przy użyciu płytek agarowych wykonanych z pożywki Gonococcus (GC), która została uzupełniona suplementem Kellogg's I i 12,5 μM azotanem żelaza (Fe(NO₃)₃). Jeśli pożądane jest wczesne naprężenie metalu, zalecamy przygotowanie płytek zasadowych GC bez Fe(NO₃)₃ i z 5 μM TPEN (N,N,N',N',N'-tetrakis (2-pirydylometylo) etylenodiamina) do chelatacji lub 10 μM deferoksaminy do chelatacji żelaza. Całą inkubację przeprowadza się w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .

1. Dwa dni przed eksperymentem, w dniu -2, gonokoki należy przerzucić z wywaru zamrażarskiego na płytki GC i inkubować nie dłużej niż 24 godziny.
2. W dniu -1 rozłóż pojedyncze kolonie na świeżych płytkach GC Medium. Spróbuj to zrobić 14–16 godzin przed eksperymentem ze wzrostem.
3. W dniu eksperymentu dodaj 5-10 ml 1x CDM do przemytej kwasem 125 ml przegrody bocznej kolby i użyj jej do wyślepienia kolorymetru Klett.
4. Użyj sterylnego wacika z bawełnianą końcówką, aby zaszczepić CDM ze zdrowych, pojedynczych kolonii. Wyceluj w 20 jednostek Klett.
   UWAGA: Jeśli kolorymetr Klett nie jest dostępny, odpowiedni jest również spektrofotometr. Nie ma uniwersalnego wzoru konwersji jednostek Klett na OD, ale dostępny jest przybliżony przewodnik (https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales).
5. Inkubować z wytrząsaniem z prędkością 250 obr./min, aż do podwojenia około jednej masy (40 jednostek Kletta). Powinno to zająć od 1 do 2 godzin.
6. W tym momencie kultury są ponownie rozcieńczane przez dodanie wystarczającej objętości CDM, aby osiągnąć połowę początkowej gęstości kultury (np. jeśli 5 ml kultury wzrosło z 20 do 40 jednostek Kletta, 15 ml CDM zmniejszy ją z powrotem do 10 jednostek Kletta), a wzrost będzie kontynuowany jak w kroku 4.5. Konkretna ilość rozcieńczenia wstecznego, obróbki metali itp. zależy od dalszych zastosowań. Poniżej podajemy trzy przykłady

5. Testy wzrostu z ograniczoną ilością metali

UWAGA: Te testy opisują gotowe premiksy wzrostowe. Przygotowanie tych mieszanek opisano w punkcie 6.

1. Podczas podwajania masy w kroku 4.5 należy wstępnie potraktować studzienki 96-dołkowej mikropłytki 10-krotnymi premiksami. Dodatkowo wyznacz trzy studzienki, które będą służyć jako półfabrykaty. Do tych studzienek dodać 10 μl 10x premiksu i 90 μl CDM.
2. Gdy hodowle w kolbach broni bocznej zostaną podwojone, dodać 100 μl każdej kultury do nieużywanego dołka w mikropłytce i zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nm (OD600). Można to zrobić za pomocą kuwet w spektrofotometrze, ale przy większej liczbie szczepów w teście może to stać się uciążliwe i generalnie nie jest zalecane, chyba że spektrofotometr może mierzyć bezpośrednio z ramienia kolby bocznej.
   1. Podczas pomiaru średnicy zewnętrznej należy umieścić kolby z powrotem w inkubatorze, aby upewnić się, że gonokoki pozostają zdolne do życia.
3. Obliczyć prawidłową ilość rozcieńczenia wymaganą do doprowadzenia kultur do OD600 = 0,02. Premiksy 10x mają znikomy wpływ na OD i można je pominąć w obliczeniach.
4. Rozcieńczyć kultury CDM w małych probówkach hodowlanych i dodać wystarczającą objętość, aby rozcieńczyć 10x premiksy do 1x na płytce. Jeśli dostępny jest podgrzewacz do płyt, utrzymuj go w temperaturze 37 °C podczas pracy.
5. Inkubować płytkę przez 8–12 godzin, wytrząsając ją w czytniku płytek, wykonując pomiary OD600 w żądanych odstępach czasu.

6. Ładowanie transferyny, S100A7 i kalprotektyny do metalu oraz przygotowanie 10x premiksów

UWAGA: Podobnie jak w przypadku preparatu CDM, do przygotowania roztworu należy użyć szkła lub plastiku umytego kwasem.

1. Ludzką transferynę rozpuścić w stężeniu 10 mg/ml (125 μM) w buforze początkowym (100 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO₃, pH = 8,4). S100A7 i kalprotektyna są zawieszone w buforze składającym się z 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 10 mM 2-merkaptoetanolu i 1 mM chlorku wapnia lub CaCl₂, pH = 8,0).
   1. Dodać roztwór ferracyjny (100 mM cytrynianu sodu, 100 mM NaHCO₃, 5 mM sześciowodnego chlorku żelaza(III) lub FeCl 3-6H₂O, pH = 8,4) do roztworu transferyny, aby osiągnąć 30% nasycenia żelaza (np. 75 μl roztworu ferracyjnego jest odpowiednie na 5 ml transferyny, jeśli jest wykonane w stężeniu 10 mg/ml).
   2. Dodaj siarczan (_ZnSO4) do S100A7 lub kalprotektyny w stosunku 50% molowym do białka, aby uzyskać 25% nasycenia (każda cząsteczka białka ma dwa miejsca wiązania metali). Można stosować preparaty 100 μM S100A7 lub kalprotektynę z 50 μM_ZnSO4 .
   3. W obu przypadkach należy odczekać co najmniej 1 godzinę mieszania od końca do końca w celu załadunku metalu.
2. Przygotować 4 l buforu do dializy (40 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO₃, pH = 7,4). Podzielić to na dwie oddzielne objętości o pojemności 2 litrów i umieścić jedną w temperaturze 4 °C.
3. Dodać białka naładowane metalem do kasety dializacyjnej za pomocą strzykawki i dializować względem pierwszej objętości buforu przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.
4. Przenieść kasetę do drugiej objętości buforowej i dializować przez noc w temperaturze 4 °C. Po wykonaniu tych czynności należy usunąć wszelkie niezwiązane metale.
   UWAGA: Zalecamy wykonanie testu kwasu bicinchoninowego w celu określenia stężenia białka po dializie.
5. Użyj 10-krotnego premiksu transferyny do wykorzystania transferyny jako jedynego źródła żelaza.
   1. Przygotować ten premiks przez rozcieńczenie 30% ludzkiej transferyny żelaza i bydlęcej apo-transferyny (przygotowanych w temperaturze 125 μM zgodnie z opisem dla transferyny ludzkiej, bez etapu ładowania żelazem) odpowiednio do 75 μM i 30 μM w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Premiks kontroli pozytywnej zastępuje 30% transferyny Fe 75 μM Fe(NO)₃, a premiks kontroli ujemnej pomija wszelkie dodane żelazo, zachowując tylko bydlęcą apo-transferynę. W teście wzrostu rozcieńczyć 10 μl tych koncentratów 90 μl kultury. Końcowe stężenia wynoszą 7,5 μM 30% ludzkiej Fe-transferyny i 3 μM bydlęcej apo-transferyny.
6. Użyj zmodyfikowanej wersji premiksu transferyny 10x do wykorzystania S100A7 lub kalprotektyny jako jedynego źródła.
   1. W przypadku premiksu do kontroli dodatniej należy wprowadzić 50 μM_ZnSO4 do premiksu transferyny. W celu kontroli ujemnej należy dodać 50 μM TPEN i pominąć. Następnie weź 10 μl każdego z nich na każdą potrzebną próbkę i przenieś tę objętość do nowej probówki. Dodaj do tego o połowę mniej objętości sterylnego PBS. Na przykład, jeśli 10 studzienek otrzyma premiks kontroli pozytywnej, weź 100 μl premiksu, przenieś go do nowej probówki i dodaj 50 μl PBS. To samo należy zrobić w odniesieniu do kontroli ujemnej.
   2. Aby przygotować premiks S100A7 lub kalprotektynę, weź 10 μl premiksu kontroli ujemnej na potrzebny studzienek, przenieś do nowej probówki i dodaj połowę tej objętości 25% Zn-S100A7 lub kalprotektyny. W teście wzrostu użyć 15 μl premiksu i rozcieńczyć 85 μl kultury. Końcowe stężenia transferyn pozostają takie same jak w kroku 8.5, z dodatkiem 5 μM Zn, TPEN lub S100A7/kalprotektyny.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolby boczne o pojemności 125 ml	Bellco powiedział:	2578-S0030	Musi być zamówiony na zamówienie
2-merkaptoetanol	Firma VWR	Zobacz materiał M131	Otwarte w dygestorium
Papier 3MM	GE Zdrowie	3030-6461	Nazywana w tekście "bibułą filtracyjną"
Agarozy	Biolone (w języku angielskim)	BIO-41025 powiedział:	Proszek
Chlorek amonu	Sigma-Aldrich	A9434 (wersja angielska)	Proszek
Transferyna bydlęca	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T1428	Proszek
Chlorek wapnia dwuwodny	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C5080	Proszek
Pantotenian wapnia	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C8731	Proszek
Kalprotektyna	N/A	N/A	Jest to dla nas możliwe dzięki współpracy
Żywica Chelex-100	Bio-Rad	142-2832	Przed użyciem umyć wodą dejonizowaną
Sterylny wacik z bawełnianą końcówką	Puritan	25-806	Bawełna jest lepsza niż poliester do tego zastosowania
Deferoksamina	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D9533	Proszek
D-glukoza	Sigma-Aldrich	Kontroler G8270	Proszek
Kaseta do dializy	Thermo	66380	Przed użyciem zanurzyć się w buforze
Etanol	Koptec	Zobacz materiał V1016	Ciecz łatwopalna, przechowywana w szafce na materiały łatwopalne
Chlorek żelaza	Sigma-Aldrich	F7134 powiedział:	Działa drażniąco, nie wdychać
Azotan żelaza niewodny	Sigma-Aldrich	F1143 powiedział:	Działa drażniąco, nie wdychać
GC średnia baza	Firma Difco	228950	Proszek, zawiera już agar
Glicyna	Sigma-Aldrich	Klasa g8898 powiedział:	Proszek
HEPESY	Rybak	L-15694	Proszek
Transferyna ludzka	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T2030	Proszek
Hipoksantyna	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał H9377	Proszek
Kolorymetr Klett	Manostat	37012-0000	Wykorzystuje transmisję kolorów do oceny gęstości kultur
L-alanina	Sigma-Aldrich	A7627 powiedział:	Proszek
L-arginina	Sigma-Aldrich	Ciągnik hamulcowy A5006	Proszek
L-asparagina jednowodna	Sigma-Aldrich	A8381	Proszek
L-asparaginian	Sigma-Aldrich	A9256 (wersja angielska)	Proszek
Chlorowodorek L-cysteiny	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C1276	Proszek
L-cystyna	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C8755	Proszek
L-glutaminian	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał G1251	Proszek
L-glutamina	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał G3126	Proszek
Monochlorowodorek L-histydyny	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał H8125	Proszek
L-izoleucyna	Sigma-Aldrich	I2752 powiedział:	Proszek
L-leucyna	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał L8000	Proszek
L-lizyna	Sigma-Aldrich	L5501	Proszek
L-metionina	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M9625	Proszek
L-fenyloalanina	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P2126 powiedział:	Proszek
L-prolina	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P0380 powiedział:	Proszek
L-seryna	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S4500	Proszek
L-treonina	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T8625 powiedział:	Proszek
L-tryptofan	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T0254 TGL	Proszek
L-tyrozyna	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T3754 TGL	Proszek
L-walina	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał V0500	Proszek
Siarczan magnezu	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M7506	Proszek
Metanol	Firma VWR	BDH1135-4LP	Ciecz łatwopalna, przechowywana w szafce na materiały łatwopalne
Fosforan potasu dwuzasadowy	Sigma-Aldrich	60356	Proszek
Fosforan potasu jednozasadowy	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P9791 powiedział:	Proszek
Siarczan potasu	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P0772	Proszek
Skrobia ziemniaczana	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S4251	Proszek
Zredukowany glutation	Sigma-Aldrich	Klasa G4251	Obchodź się ostrożnie. Może łatwo się utleniać.
Zobacz materiał S100A7	N/A	N/A	Jest to dla nas możliwe dzięki współpracy
Wodorowęglan sodu	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S5761	Proszek
Chlorek sodu	Firma VWR	470302	Proszek
Cytrynian sodu	Rybak	Zobacz materiał S279	Proszek
Wodorotlenek sodu	Acros Organics	383040010	Wysoce higroskopijny
Chlorowodorek tiaminy	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T4625	Proszek
Pirofosforan tiaminy	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C8754	Nazywana również kokarboksylazą
TPEN (Protokół TPEN)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P4413	Proszek
Tris	Firma VWR	497	Proszek
Uracyl	Sigma-Aldrich	U0750 powiedział:	Proszek
Siarczan siedmiowodny	Sigma-Aldrich	204986	Działa drażniąco, nie wdychać