Wykrywanie powierzchniowych transporterów metali w Neisseria gonorrhoeae za pomocą Dot Blot

Streszczenie

Źródło: Maurakis, S. i Cornelissen, CN Ograniczony metalem wzrost Neisseria gonorrhoeae w celu scharakteryzowania genów reagujących na metale i pozyskiwania metali z ligandów gospodarza. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film przedstawia procedurę wykrywania powierzchniowych transporterów metali w Neisseria gonorrhoeae hodowanych w warunkach ograniczonej zawartości metali przy użyciu testu punktowego, obejmującego wiązanie ligandów, wykrywanie przeciwciał i wizualizację kolorymetryczną.

Protokół

1. Wykrywanie wiązania ligandów przez transportery metali z membraną zewnętrzną

1. Ponownie rozcieńczyć kultury trzema objętościami CDM (zdefiniowane podłoże poddane działaniu chelexu).
2. Następnie inkubować z wytrząsaniem przez 4 godziny.
3. Na krótko przed upływem 4 godzin wytnij trzy kawałki bibuły filtracyjnej i kawałek nitrocelulozy do przybliżonego rozmiaru potrzebnego do zmieszczenia się w aparacie do plam punktowych. Namocz nitrocelulozę w wodzie dejonizowanej, a następnie zmontuj aparat z bibułą filtracyjną poniżej nitrocelulozy.
4. Po 4 godzinach należy zanotować gęstość komórek i znormalizować do odpowiedniej gęstości końcowej.
5. Odpipetować hodowle komórek na nitrocelulozę i odczekać, aż bibuła filtracyjna wchłonie całą ciecz.
6. Zdemontować aparaturę, pozostawić blot do wyschnięcia i zablokować błonę nitrocelulozową na 1 godzinę w 5% albuminie surowicy bydlęcej lub mleku beztłuszczowym (w/v) w soli fizjologicznej buforowanej Tris.
7. Ponownie zmontuj aparat do igrania w punktach plam, zastępując bibułę filtracyjną folią parafinową, aby stworzyć szczelne uszczelnienie pod nitrocelulozą.
8. Rozcieńczyć interesujący nas ligand wiążący metal do 0,2 μM w blokerze i komorze sondy przez 1 godzinę.
9. Odsysaj płyn za pomocą próżni, umyj plamę, a następnie postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami immunologicznymi, aby rozwinąć sygnał. Etapy mycia mogą być wykonywane w aparacie lub poza nim.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolby boczne o pojemności 125 ml	Bellco powiedział:	2578-S0030	Musi być zamówiony na zamówienie
2-merkaptoetanol	Firma VWR	Zobacz materiał M131	Otwarte w dygestorium
Papier 3MM	GE Zdrowie	3030-6461	Nazywana w tekście "bibułą filtracyjną"
Bloker klasy blottingu	Bio-Rad	170-6404	Odtłuszczone mleko w proszku
Albumina surowicy bydlęcej	Roche	3116964001	Proszek
Kalprotektyna	N/A	N/A	Jest to dla nas możliwe dzięki współpracy
Żywica Chelex-100	Bio-Rad	142-2832	Przed użyciem umyć wodą dejonizowaną
Sterylny wacik z bawełnianą końcówką	Puritan	25-806	Bawełna jest lepsza niż poliester do tego zastosowania
Aparat do robienia plam punktowych	Schleicher & Schwell	10484138	Zablokuj pokrywę tak mocno, jak to możliwe przed załadowaniem próbki
Etanol	Koptec	Zobacz materiał V1016	Ciecz łatwopalna, przechowywana w szafce na materiały łatwopalne
Kolorymetr Klett	Manostat	37012-0000	Wykorzystuje transmisję kolorów do oceny gęstości kultur
Metanol	Firma VWR	BDH1135-4LP	Ciecz łatwopalna, przechowywana w szafce na materiały łatwopalne
Nitroceluloza	GE Zdrowie	10600002	Przechowywać w pochwie ochronnej do czasu użycia
Zobacz materiał S100A7	N/A	N/A	Jest to dla nas możliwe dzięki współpracy
Chlorek sodu	Firma VWR	470302	Proszek
Tris	Firma VWR	497	Proszek