Pomiar wskaźników błędnej translacji Mycobacterium smegmatis za pomocą systemu reporterowego GFP/lucyferazy

Streszczenie

Źródło: Chen, Y. i in., Pomiar wskaźników błędnej translacji specyficznych prątków za pomocą systemów reporterowych wzmocnienia funkcji. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film pokazuje metodę ilościowego określania błędnej translacji w Mycobacterium smegmatis przy użyciu indukowalnego GFP i wydzielanego zmutowanego systemu reporterowego lucyferazy. Pokazuje, w jaki sposób mierzy się luminescencję wynikającą z błędnej translacji i porównuje ją z fluorescencją GFP w celu oceny wpływu badanej cząsteczki na dokładność translacji.

Protokół

1. Lucyferazy Nanoluc (Nluc)/Białko zielonej fluorescencji (GFP) Reporter

NUTA: Aby zapoznać się z wizualną reprezentacją tej metody, patrz rysunek 1.

1. Zaszczepić bakteryjny szczep reporterowy z bulionu o temperaturze -80 °C za pomocą 2 ml pożywki 7H9. Wstrząsać w temperaturze 37 °C przez 1 do 2 dni, aż OD₆₀₀ osiągnie fazę stacjonarną (OD >3).
2. Subkultura do 50 ml pożywki 7H9 i wzrost do momentu, gdy OD₆₀₀ osiągnie późną fazę stacjonarną (>4).
3. Przed przeniesieniem bakterii na 96-dołkową płytkę dodać anhydrotetracyklinę (ATC) o końcowym stężeniu 50 ng/ml i dobrze wymieszać. Indukcja hodowli masowej zapewnia, że wszystkie studzienki zawierają taką samą ilość induktora i że indukcja reportera jest zsynchronizowana. Podzielić bakterie na przezroczystą, okrągłodenną 96-dołkową płytkę, z objętością 100 μl w każdym dołku.
4. Aby przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem małych cząsteczek wpływających na szybkość błędnej translacji, dodaj związek o wskazanym stężeniu, aby wybrać dołki. Do celów niniejszego protokołu należy użyć kasumgamycyny (w dawkach wskazanych na rysunku 2) jako ilustracji. Dodaj różne dawki kasumamicyny do wybranych studzienek (każda grupa eksperymentalna powinna zawierać co najmniej dwie kontrpróby biologiczne).
5. Wstrząsnąć i indukować próbki w temperaturze 37 °C przez 16-20 godzin.
   NUTA: Konieczne jest uszczelnienie płyty folią. Ponadto wszystkie studzienki krawędziowe muszą być wypełnione co najmniej 200 μl sterylnej wody, aby ograniczyć parowanie z dołków testowych.
6. Pobrać 80 μl z każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej i przenieść próbki na czarną 96-dołkową płytkę (która maksymalizuje pomiar sygnału fluorescencji). Zmierz sygnał GFP za pomocą luminometru z czasem całkowania 20 ms.
7. Po zmierzeniu sygnału GFP odwirować płytkę o stężeniu 3,220 x g przez 10 minut. Przenieś 50 μl supernatantu na 96-dołkową płytkę z białym dnem (która maksymalizuje pomiar sygnału luminescencji), dodaj 50 μl substratu Nluc do każdej studzienki, dobrze je wymieszaj i zmierz luminescencję za pomocą luminometru z 1,000 ms jako czasem całkowania.
8. Określ stosunek Nluc/GFP, dzieląc skorygowane wartości luminescencji Nluc przez fluorescencję GFP: ta miara (w dowolnych jednostkach) jest względną miarą asparaginianu dla błędnej translacji asparaginy.

Wyniki

Rysunek 1: Zarys pomiaru wskaźnika błędnych tłumaczeń zgłaszających Nluc-GFP. Świeża kultura M. smegmatis, przekształcona za pomocą reporterów Nluc i GFP, jest hodowana do objętości wystarczającej do zbadania wszystkich płytek (zakładają...

Materiały