Synchronizacja kultur sinic i zagęszczenie DNA napędzane przez cykle światło-ciemność

Streszczenie

Źródło: Murata, K. i wsp., Wizualizacja zagęszczenia DNA u cyjanobakterii za pomocą wysokonapięciowej krioelektronowej tomografii. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film pokazuje synchroniczną hodowlę cyjanobakterii w cyklach światła i ciemności w celu zbadania regulowanego okołodobowo zagęszczenia DNA. Mikroskopia fluorescencyjna ujawnia skondensowane DNA w określonych punktach czasowych, potwierdzając wyrównanie cyklu komórkowego w całej populacji.

Protokół

1. Synchroniczna hodowla sinic

1. Kultura Synechococcus elongatus PCC 7942 na wysterylizowanej niebiesko-zielonej pożywce 11 (BG 11) (na sterylnej plastikowej szalce Petriego o średnicy 9 cm) zawierającej 1,5% (m/v) agaru i 0,3% (w/v) tiosiarczanu sodu.
2. Umieścić płytki w komorze wzrostowej w temperaturze 23 °C o natężeniu światła 50 μE/^m2/s i poddać je cyklom 12 godzin światła/12 godzin ciemności.
3. Raz w tygodniu przenieś komórki na świeże płytki agarowe BG11.
   NUTA: Kultury na agarze pojawią się jako zielone pasma aktywnie proliferujących komórek po tygodniu w tych warunkach hodowli.
4. Weź zielone grudki komórek za pomocą wysterylizowanej płomieniem drucianej pętli i rozłóż komórki na świeżej płytce agarowej BG11. Zrób to na czystej ławce.

2. Monitorowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

1. Użyj komórek hodowanych na płytce agarowej przez 6 dni, aby obserwować zagęszczenie DNA. Zebrać komórki z płytki pod koniec okresu światła, wlewając 1 ml 0,2 M roztworu sacharozy na komórki. Powtórz wlewanie roztworu na komórki, tak aby większość komórek została zebrana. Przenieś roztwór zawieszonych komórek do mikroprobówki w celu barwienia DNA.
2. Dodać roztwór barwnika barwiącego DNA (np. Hoechst 33342) do 500 μl zawieszonego roztworu komórkowego w mikroprobówce do końcowego stężenia 1 μg/ml. Następnie trzymaj probówkę w ciemności przez 10 minut.
3. Wirować przez 1 minutę przy 2 000 x g w celu osadzenia komórek. Odrzucić supernatant i dodać 10 μl 0,2 M roztworu sacharozy w celu uzyskania gęstej zawiesiny komórek.
4. Przenieść 1 μl roztworu zawierającego wybarwione komórki do szkiełka szkiełkowego, nałożyć szkiełko nakrywkowe i obserwować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtr ultrafioletowy (UV) przy użyciu soczewki obiektywowej o powiększeniu 100X i olejku immersyjnego.
5. Upewnij się, że w tym momencie w większości komórek obserwuje się zagęszczenie DNA.

Materiały