Synteza stabilizowanych nanodyskami antygenów białek błonowych przy użyciu systemu bezkomórkowego

Streszczenie

Źródło: Gilmore, S. F., et al. Bezkomórkowa skalowana produkcja i adiuwantowe dodawanie do rekombinowanego głównego białka błony zewnętrznej z Chlamydia muridarum w celu opracowania szczepionki. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film demonstruje bezkomórkową syntezę stabilizowanych nanodyskami błonowych antygenów białkowych przy użyciu systemu dwukompartmentowego. Urządzenie utrzymuje optymalne warunki do wydajnej syntezy białek, prawidłowego fałdowania i stabilnej integracji w nanodyski.

Protokół

Bezkomórkowa produkcja głównych cząstek nanolipoprotein telodendrimer białkowych i błony zewnętrznej (MOMP-tNLP) do preparatów szczepionek podjednostkowych

1. Przygotuj MOMP-tNLP przy użyciu metod bezkomórkowych.
   1. Dwie godziny przed rozpoczęciem reakcji bezkomórkowej otwórz zestaw do ekspresji białka bezkomórkowego prokariotycznego i rozmrozić jeden z do rekonstytucji. Po rozmrożeniu dodaj jedną tabletkę koktajlu inhibitorów proteazy bez kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i pozwól mu całkowicie się rozpuścić.

2. Postępuj zgodnie z tym protokołem, używając zestawu zaprojektowanego do przeprowadzania reakcji 5 x 1 ml.

   NUTA: Typowa produkcja na dużą skalę to 3 x 1 ml.

   1. Na każdy 1 ml reakcji dodać 525 μl buforu do rozpuszczenia do butelki z lizatem E. coli i delikatnie przetoczyć do rozpuszczenia. Dodać 250 μl buforu do rozpuszczenia do butelki zawierającej dodatki reakcyjne (np. trifosforan adenozyny, trifosforan guanozyny) i delikatnie rozwałkować do rozpuszczenia.
   2. Dodać 8,1 ml buforu do rozpuszczenia do butelki z reakcyjnym płynem, ponownie zakryć gumowym korkiem (należy uważać, aby nie dotknąć wnętrza gumowego korka) i delikatnie odwrócić/zwinąć do rozpuszczenia.
   3. Dodać 3 ml buforu do rozpuszczenia do butelki z mieszaniną aminokwasów, zamknąć gumowym korkiem i delikatnie odwrócić/zwinąć do rozpuszczenia.
      NUTA: Uważaj, aby nie dotknąć wnętrza gumowego korka, ponieważ może to prowadzić do zanieczyszczenia.
   4. Dodać 1,8 ml buforu do rozpuszczenia do butelki z metioniną, delikatnie rozwałkować do rozpuszczenia, a następnie przechowywać na lodzie do czasu użycia.
       
3. Przygotować roztwór reakcyjny.
   1. Do butelki z lizatem E. coli dodać 225 μl odtworzonej mieszaniny reakcyjnej, 270 μl odtworzonej mieszaniny aminokwasów bez metioniny i 30 μl odtworzonej metioniny. Dodatkowo dodać 400 μl mieszaniny 1,2-dimyrystoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DMPC)/telodendrymeru, 15 μg plazmidu MOMP i 0,6 μg plazmidu Δ49ApolipoproteinA1. Rozwałkuj/delikatnie wstrząśnij, aby wymieszać.
      NUTA: Upewnij się, że oba plazmidy są zbudowane z tego samego szkieletu plazmidu. Nie wirować.
   2. Pobrać 20 μl całego roztworu i odłożyć go do probówki o pojemności 1,5 ml do reakcji kontrolnej z ekspresją białka zielonej fluorescencji (GFP) (patrz poniżej).
       
4. Przygotuj roztwór paszowy. Do butelki z mieszanką paszową dodać 2,65 ml odtworzonej mieszanki aminokwasów bez metioniny i 300 μl odtworzonej metioniny. Zwiń/delikatnie wstrząśnij do rozpuszczenia.
   NUTA: W tym czasie niewykorzystany bufor do rozpuszczenia i metioninę można zwrócić do zamrażarki w celu przechowywania.
    
5. Przenieść 1 ml roztworu reakcyjnego do wewnętrznej komory reakcyjnej znajdującej się w bezkomórkowym zestawie reakcyjnym i zamknąć po napełnieniu. Przenieść 10 ml roztworu pokarmowego do zewnętrznej komory naczynia reakcyjnego i zamknąć.
   NUTA: Nie przepełniaj komór! Obecność pęcherzyków powietrza w górnej części zarówno wewnętrznej komory reakcyjnej, jak i wewnętrznej komory zasilającej niekorzystnie wpłynie na reakcję. Pozostały roztwór reakcyjny można umieścić w probówce o pojemności 1,5 ml i pozostawić do wymieszania z naczyniem głównym.
    
6. Dodać 0,5 μl plazmidu kontrolnego GFP (0,5 mg/ml) do uprzednio podzielonej mieszaniny reakcyjnej o objętości 20 μl.
   NUTA: Wiele zestawów jest dostarczanych z plazmidem kontrolnym do celów kontroli jakości. Większość plazmidu wykazującego ekspresję GFP z promotorem T7 i miejscem wiązania rybosomów E. coli (RBS) może być również używana jako plazmid kontrolny.
    
7. Umieścić reakcję w wytrząsarce o prędkości 300 obr./min, 30 °C na okres do 18 godzin. Aby sprawdzić, czy reakcja przebiegła pomyślnie, należy użyć źródła światła UV, aby sprawdzić fluorescencję w wyniku syntezy kontrolnego GFP (ryc. 1) już po 15 minutach inkubacji.
   NUTA: Warunki te, w szczególności temperatura, mogą wymagać optymalizacji pod kątem ekspresji innych białek błonowych.

Wyniki

Rysunek 1: Ekspresja i oczyszczanie MOMP-tNLP. (A) Obraz probówek zawierających małe porcje reakcji bezkomórkowej, która z powodzeniem wyrażała kontrolki GFP świecące w świetle UV (po prawej) w porównaniu z lizatami ...

Materiały