Western blot do oceny integralności strukturalnej bakteryjnego antygenu szczepionkowego

Streszczenie

Źródło: Gilmore, S. F. i wsp. Bezkomórkowa skalowana produkcja i adiuwantowe dodawanie do rekombinowanego głównego białka błony zewnętrznej z Chlamydia muridarum w celu opracowania szczepionki. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film demonstruje zastosowanie Western blotting do oceny integralności strukturalnej głównego białka błony zewnętrznej (MOMP) w kompleksach szczepionek opartych na nanocząsteczkach. Przedstawiono w nim kluczowe etapy związane z transferem białek, znakowaniem przeciwciał i obrazowaniem fluorescencyjnym.

Protokół

1. Western blot

1. W przypadku western blotting należy rozpuścić główne białka błony zewnętrznej (MOMP) – cząstki nanolipoprotein telodendrimer (tNLP) za pomocą SDS-PAGE i przenieść żele za pomocą komercyjnego systemu suchego blottingu ze standardowymi ustawieniami zgodnie z protokołem producenta.
   1. Po zakończeniu transferu usunąć blot ze stosu i inkubować każdą plamę przez noc w temperaturze 4 °C w odpowiednim buforze blokującym zawierającym 0,2% Tween 20 i 0,5 mg/ml przeciwciała monoklonalnego (MAb) 40 lub 0,2 mg/ml przeciwciała anty-His-tag MAbHIS skierowanego przeciwko znacznikowi Hisa z białka Δ49ApoA1.
      NUTA: Rozcieńczenia przeciwciał stosowane do blottingu wynoszą 1:1,000 dla MAb40 i 1:500–1,000 dla przeciwciała MAbHIS.
   2. Umyj każdą plamę 3 razy przez 5 minut PBS-T (1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 0,2% Tween 20, pH 7,4).
   3. Inkubować bloty przez 1 godzinę w buforze blokującym zawierającym przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem (np. barwnikiem w podczerwieni (IRDye)) w rozcieńczeniu 1:10 000.
   4. Umyj bloty 3 razy przez 5 minut za pomocą PBS-T. Użyj imagera fluorescencyjnego, aby zobrazować plamy po ostatnim praniu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
iBlot+2:22 System suchego blottingu	Technologie życiowe
Stosy transferowe iBlot 2, PVDF	Technologie życiowe	IB24001
Oprogramowanie Image Studio V2.0	Li-COR Biiosciences
Membrana PVDF Immun-Blot	Bio-Rad	1620177
Kamera LI-COR Odyssey Fc	Li-COR Biiosciences
Bufor blokujący Odyssey w TBS zawierający 0,2% animacji 20	Li-COR Nauki biologiczne	927-50000
Wytrząsarka orbitalna
PBS-T (1x PBS, 0,2% Tween 20, pH 7,4)
Przeciwciało pierwszorzędowe: MAb40 (przeciwciało monoklonalne przeciwko zmiennej domenie 1 (VD1) C. muridarum MOMP
Przeciwciało pierwszorzędowe: MAbHIS, przeciwciało Penta-His	Qiagen powiedział:	34660
Przeciwciało wtórne: IRDye 800CW kozia (poliklonalna) anty-mysie IgG (ciężka i lekka)	Li-COR Nauki biologiczne	926-32210