Przygotowanie i przemiana bakterii za pomocą elektroporacji wysokonapięciowej

Abstract

Źródło: Stefan, A. i wsp., Wieloaspektowe korzyści z koekspresji białek w Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)

Ten film przedstawia procedurę przekształcania Escherichia coli w plazmid przenoszący gen oporności na antybiotyki, w tym przygotowanie komórek, elektroporację, odzyskiwanie i selekcję transformantów.

Protocol

1. Izolacja kotransformantów E. coli

1. Przygotować elektrokompetentne komórki odpowiedniego szczepu E. coli do transformacji. Przenieść do 1 ml pożywki Luria-Bertani (LB) (trypton, ekstrakt drożdżowy, NaCl odpowiednio w stężeniu 10, 5 i 10 g/l) pojedynczej kolonii wybranego szczepu i inkubować w temperaturze 37 °C w warunkach wytrząsania 180 obr./min. Rozcieńczyć kulturę wstępną w stosunku 1:500 w 25 ml świeżej pożywki LB i inkubować kulturę w temperaturze 37 °C.
2. W fazie logarytmicznej (0,6 średnicy zewnętrznej lub gęstość optyczna) odwirować zawiesinę komórek przy 5,000 x g przez 20 minut i ponownie zawiesić osad w 10%, v/v lodowato zimnej sterylnej glicerolu-wodzie w połowie pierwotnej objętości hodowli. Powtórzyć ten krok 4 razy, zmniejszając o połowę objętość zawieszenia. Na koniec ponownie zawiesić osad w glicerolu/wodzie i podzielić zawiesinę komórkową na 50 μl podwielokrotności. Podwielokrotności należy przechowywać w temperaturze -80 °C do 6 miesięcy.
3. Rozpuść żądany plazmid w sterylnej wodzie uzupełnionej 0,5 mM EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy). Rozmrozić podwielokrotność elektrokompetentnych komórek na lodzie i wymieszać z odpowiednią ilością (2,5-5 ng) wektora. Dozować mieszaninę do kuwety o średnicy 0,1 cm nadającej się do elektroporacji i zastosować napięcie 1,8 kV.
4. Natychmiast przenieś elektroporowane komórki do 1 ml pożywki SOC (super optymalny bulion z represją kataboliczną) (pożywka LB uzupełniona 0,2% w/v glukozy, 10 mM MgCl₂, 2,5 mM KCl), inkubuj przez 1 godzinę pod wstrząsaniem, a na koniec przenieś 100 μl porcji na szalki Petriego zawierające agar LB z odpowiednim antybiotykiem. Inkubować O/N w temperaturze 37 °C.
5. Oczyść transformanty, rozrzucając pojedyncze kolonie na szalkach Petriego.

Materials