$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Izolacja kotransformantów Escherichia coli lub E. coli
- Przygotować elektrokompetentne komórki odpowiedniego szczepu E. coli do transformacji. Przenieść do 1 ml pożywki Luria-Bertani (LB) (trypton, ekstrakt drożdżowy, chlorek sodu lub NaCl odpowiednio w stężeniu 10, 5 i 10 g/l) pojedynczej kolonii wybranego szczepu i inkubować w temperaturze 37 °C w warunkach wytrząsania 180 obr./min. Rozcieńczyć kulturę wstępną w stosunku 1:500 w 25 ml świeżej pożywki LB i inkubować kulturę w temperaturze 37 °C.
- W fazie logarytmicznej (0,6 s.d.) odwirować zawiesinę komórek o stężeniu 5 000 x g przez 20 minut i ponownie zawiesić osad w 10%, v/v lodowato zimnej sterylnej glicerolu-wodzie w połowie pierwotnej objętości hodowli. Powtórzyć ten krok 4 razy, za każdym razem zmniejszając o połowę objętość zawieszenia. Na koniec ponownie zawiesić osad w glicerolu/wodzie i podzielić zawiesinę komórkową na 50 μl podwielokrotności. Podwielokrotności należy przechowywać w temperaturze -80 °C do 6 miesięcy.
- Rozpuść żądany plazmid w sterylnej wodzie uzupełnionej 0,5 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA). Rozmrozić na lodzie podwielokrotność elektrokompetentnych ogniw i wymieszać z odpowiednią ilością (2,5-5 ng) wektora. Dozować mieszaninę do kuwety o średnicy 0,1 cm nadającej się do elektroporacji i zastosować napięcie 1,8 kV.
- Natychmiast przenieś elektroporowane komórki do 1 ml super optymalnego bulionu z pożywką do represji katabolitycznej (SOC) (pożywka LB uzupełniona 0,2% w/v glukozy, 10 mM chlorku magnezu lub MgCl2, 2,5 mM chlorku potasu lub KCl), inkubować przez 1 godzinę pod wstrząsaniem, a na koniec przenieść 100 μl podwielokrotności na szalki Petriego zawierające agar LB z odpowiednim antybiotykiem. Inkubować przez noc (O/N) w temperaturze 37 °C.
- Oczyść transformanty, rozrzucając pojedyncze kolonie na szalkach Petriego.
- Przygotować elektrokompetentne ogniwa transformatorów pierwotnych i powtórzyć kroki od 1.1 do 1.5, aby przekształcić się w kolejne plazmidy.
- Przygotować zapasy glicerolu kotransformantów. Przenieść pojedynczą kolonię w LB uzupełnioną odpowiednimi antybiotykami, inkubować w temperaturze 37 °C pod wstrząsami, a następnie w fazie logarytmicznej (0,6 s.d.) odwirować zawiesinę komórkową przy 5 000 x g przez 20 min. Zawiesić osad w pożywce LB-antybiotykowej zawierającej 15% v/v glicerolu. Dozować w porcjach i przechowywać w temperaturze – 80 °C.
2. Analiza mutacji w populacjach wykazujących współekspresję podjednostki ε typu dzikiego polimerazy DNA III E. coli i mutagennego wariantu εD12A
- Przenieść pojedynczą kolonię E. coli TOP10 zawierającą wektory pBAD-ε i pGOOD1-εD12A do 1 ml pożywki LB-antybiotykowej. Inkubować O/N w temperaturze 37 °C.
- Rozcieńczyć kulturę wstępną w stosunku 1:250 w 3 kolbach zawierających świeżą pożywkę (10 ml), dodać odpowiednie induktory (arabinozę, β-d-1-tiogalaktopiranozyd izopropylu (IPTG) lub arabinozę i IPTG, po 1 mM każdy) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 8 godzin. Przygotuj równolegle kultury nieindukowane.
- Zebrać porcje o objętości 1 ml, a następnie rozcieńczyć w stosunku 1:500 w nowych kolbach zawierających świeżą pożywkę (10 ml) uzupełnioną lub nie odpowiednimi induktorami. Inkubować O/N w temperaturze 37 °C.
- Powtórzyć kroki 2.2 i 2.3 i zebrać podwielokrotności po 1 ml.
- Określ liczbę pokoleń, które wystąpiły w każdej kulturze. Przenieść na płytki LB 100 μl odpowiednich seryjnych rozcieńczeń inokulum i kultury. Inkubować O/N w temperaturze 37 °C. Policz kolonie na płytkach LB i oblicz logarytm liczby komórek obecnych w inokulum (logI) i w kulturze pod koniec wzrostu (logC). Aby określić liczbę pokoleń, użyj wzoru: (logC– logI)/0,301.
- Odwirować przy 5 000 x g przez 20 minut i ponownie zawiesić komórki w 1 ml 50 mM chlorowodorku tris(hydroksymetylo)aminometanu (Tris-HCl), pH 7,6, 50 mM NaCl. Aby przepuszczalność komórek, dodaj 2-3 krople chloroformu i wiruj przez 20 sekund.
- Oznaczyć aktywność β-glukozydazy każdej podwielokrotności w 96-dołkowej mikropłytce, używając p-nitrofenylo-β-D-glukopiranozydu (PNPGluc) jako substratu. Dodać do każdej studzienki 100 μl przepuszczalnych komórek i 100 μl substratu (16 mg/ml roztworu podstawowego w wodzie lubH2O). Uważaj, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza w studzienkach. Odczytać absorbancję przy 420 nm, używając czytnika mikropłytek i odpowiedniego filtra.