Ekstrakcja i oczyszczanie plastoglobul z bakterii fotosyntetycznych

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Shivaiah, K., et al. Izolacja kropelek lipidów plastoglobuli z tkanki liści roślin i cyjanobakterii. J. Vis. Exp. (2022)

Film przedstawia izolację plastoglobul od sinic. Rozpoczyna się od hodowli cyjanobakterii i przechodzi przez rozbijanie komórek za pomocą siły mechanicznej. Uwolnienie pigmentów fotosyntetycznych wskazuje na udaną lizę. Gradient krokowy sacharozy jest następnie używany do oddzielania składników komórkowych według gęstości, umożliwiając plastoglobulkom o niskiej gęstości utworzenie wyraźnego pasma u góry. Frakcja ta jest zbierana i przechowywana do dalszej analizy.

Protokół

1. Surowa izolacja plastoglobuli

Surowa ekstrakcja plastoglobul z sinic
1. Hoduj 50 ml kultury Synechocystis sp. PCC 6803 do fazy stacjonarnej (około 7-10 dni) i dostosuj gęstość komórek do gęstości optycznej przy 750 nm (OD₇₅₀) wynoszącej 2,0 za pomocą spektrofotometru. W warunkach hodowli należy użyć pożywki BG-11 i hodować w inkubatorze przy natężeniu światła 150 μmol fotonów/m²/s, 2% CO₂ , 32 °C i przy ciągłym wytrząsaniu przy 150 obrotach na minutę (rpm).
2. W celu usunięcia polisacharydów należy przepłukać komórki, odwirowując 50 ml kultury o stężeniu 6 000 × g przez 45 minut w temperaturze 4 °C, a następnie usunąć supernatant. Kontynuuj, przemując komórki dwukrotnie w 50 ml buforu A (Tabela 1). Usunąć podwielokrotność homogenatu komórkowego i odłożyć ją na bok przed odwirowaniem, aby była przechowywana jako reprezentatywna próbka komórkowa ogółem
3. Ponownie zawiesić przemyty osad w 25 ml buforu A i rozbić komórki za pomocą francuskiej celi ciśnieniowej o temperaturze 1,100 funtów na cal kwadratowy (psi), powtarzając proces 3× (umieść próbkę na lodzie między każdym cyklem, aby uniknąć denaturacji białka), aż zlizowany kolor zmieni się z zielonego na czerwono-niebiesko-zielony w białym świetle. Użyj wstępnie schłodzonego ogniwa i wykonaj ten krok w chłodni.
4. Powstały homogenat rozprowadzić między ośmioma probówkami ultrawirówkowymi o pojemności 3 ml wypełnionymi maksymalnie do 2,5 ml w każdej probówce, a następnie ostrożnie nałożyć na 400 μl pożywki R, tworząc gradient krokowy.
5. Ostrożnie zrównoważyć probówki, dodając w razie potrzeby dodatkowe medium R, i odwirować przez 30 minut w temperaturze 150 000 × g w temperaturze 4 °C. Tyrakosteroidy i inne cięższe organelle (w tym wszelkie ciała polihydroksyalkanianowe) będą się osadzać, podczas gdy plastoglobule będą łatwo widoczne jako żółta, oleista podkładka na lub w pobliżu szczytu gradientu sacharozy (ryc. 1C).
6. Za pomocą strzykawki i igły 22G zbierz powstałą pływającą podkładkę z surowych plastoglobul i umieść ją w probówce o pojemności 2 ml. W razie potrzeby zeskrobać plastoglobulki z boku ścianki probówki ultrawirówki za pomocą końcówki igły.
7. Przejdź do kroku 2.2. Alternatywnie, surowe plastoglobulki należy przechowywać w temperaturze -80 °C i oczyścić później.

Tabela 1: Receptury do izolacji plastoglobul z tkanki liści roślin lub sinic.

Kompozycje ^{buforowe a}
Bufor szlifierski	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM Chlorek magnezu (MgCl₂)
	100 mM sorbitolu
	5 mM kwas askorbinowy ^b
	5 mM zredukowana cysteina ^b
	0,05 % (w/v) Albumina surowicy bydlęcej (BSA) ^b
Średnie R	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM MgCl₂
Średni R 0,2	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM MgCl₂
	0,2 M sacharozy
Średni R 0,7	50 mM HEPES-KOH (pH 8,0)
	5 mM MgCl₂
	0,7 M sacharozy
Bufor A	25 mM HEPES-KOH (pH 7,8)
	250 mM sacharozy
a. Podano końcowe stężenia każdego składnika buforowego.
b. Musi być dodany świeży w dniu izolacji. Podczas gdy można przygotować dzień przed izolacją, niektóre składniki muszą być dodane świeże w dniu izolacji, podobnie jak wszelkie inhibitory fosfatazy i proteazy.

2. Zbiór czystych plastoglobul

Przetwarzanie cyjanobakterii
1. Wytwarzać gradient sacharozy w czterech probówkach ultrawirówek o pojemności 2,5 ml, najpierw ułóż warstwy z 500 μl surowych plastoglobul z kroku 1.3 zmieszanych z 750 μl pożywki R 0,7, a następnie zalej 750 μl pożywki R 0,2.
2. Odwirować gradient sacharozy w temperaturze 150 000 × g przez 90 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać czyste plastoglobulki (ryc. 1C) za pomocą strzykawki i igły 22 G z górnej fazy gradientu sacharozy i przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml.
3. Podaczuj czyste plastoglobule i błyskawicznie zamrażaj w ciekłym azocie. Przechowywać bezpośrednio w temperaturze -80 °C lub liofilizować do postaci suchego proszku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rycina 1: Izolacja i immunoblotting plastoglobulek i tylakoidów. (A) Reprezentatywna oczyszczona próbka plastoglobuli z Z. mays przed ekstrakcją z gradientu sacharozy. (B) Reprezentatywna surowa próbk...