Ocena kolonizacji bakteryjnej jelit u C. elegans wolnych od zarazków

Streszczenie

Źródło: Taylor, M. N., et.al. Wykorzystanie danych dotyczących pojedynczego robaka do ilościowego określenia niejednorodności interakcji Caenorhabditis elegans z bakteriami. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film pokazuje narażenie wolnych od zarazków, dopasowanych do wieku robaków Caenorhabditis elegans na szczep bakteryjny w celu kolonizacji jelit. Wyjaśnia selektywne usuwanie nieprzylegających i zewnętrznych bakterii, pozostawiając tylko żywe bakterie przylegające do nabłonka jelitowego w celu ilościowego określenia.

Protokół

1. Karmienie robaków żywymi bakteriami w płynnej kulturze

NUTA: Protokół ten służy do kolonizacji robaków bakteriami wyhodowanymi w laboratorium w dobrze wymieszanych warunkach w płynnej kulturze. Robaki mogą być kolonizowane pojedynczymi izolatami z czystej kultury (np. Patogeny, takie jak Enterococcus faecium) lub mieszaninami izolatów (np. Minimalne zbiorowiska mikrobiomu).

1. Zacznij od zsynchronizowanych dorosłych robaków przemytych sacharozą w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Umyć robaki raz w 12 ml buforu S i wyrzucić sklarowany nad osadem.
2. Ponownie zawiesić umyte robaki w objętości pożywki S potrzebnej do eksperymentu. Weź pod uwagę objętość warunków eksperymentalnych, liczbę warunków, w których robaki zostaną podzielone, oraz końcowe stężenia robaków i bakterii.
   NUTA: Żerowanie robaków różni się w zależności od dostępności bakterii, a robaki mogą być zestresowane przez stłoczenie. Do kolonizacji w kulturze płynnej zaleca się <1000 robaków/ml i >10⁷ jtk/ml; 10¹¹ jtk/ml jest uważane za gęstość karmienia E. coli "ad libitum".
3. Odwiruj kultury bakterii. Odlej supernatant; Aspiracja lub pipetowanie mogą być stosowane w celu usunięcia supernatantu dla bakterii, które tworzą luźne granulki.
   NUTA: W przypadku kultur >5 ml przenieś do probówek o pojemności 15 ml i wiruj przy ~2800 x g w dużej wirówce stołowej przez 8-10 minut. Kultury <5 ml można przenieść do probówek o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 9000 x g przez 1-2 minuty w małej wirówce stołowej. Wysoce ruchliwe bakterie (np. wiele gatunków Pseudomonas) mogą wymagać schładzania w temperaturze 4 °C przez 10-15 minut, aby ułatwić tworzenie stabilnego osadu, i może być lepsze odwirowanie w temperaturze 4 °C.
4. Ponownie zawiesić kultury bakteryjne w jednej objętości buforu S i ponownie odwirować do osadzania. Usunąć i wyrzucić supernatant jak poprzednio.
5. Ponownie zawiesić kultury bakteryjne w pożywce S o pożądanej gęstości do eksperymentu, plus wszelkie antybiotyki do selekcji. Antybiotyki, które należy zastosować, jeśli takie istnieją, będą zależeć od profilu oporności bakterii stosowanych do kolonizacji.
6. Za pomocą końcówki pipety pokrytej buforem ślimakowym M9 uzupełnionym 0,01% Triton X-100 (M9TX-01), pipety delikatnie przesuwaj w górę i w dół, aż robaki zostaną dokładnie zawieszone w pożywce S, a następnie przenieś do probówek lub dołków płytkowych w celu kolonizacji bakteryjnej.
7. Dodaj zawiesinę bakteryjną do każdej kultury robaków, aby osiągnąć pożądane stężenie bakterii i końcową objętość.
8. Jeśli do kolonizacji używana jest płytka wielodołkowa, przykryj ją sterylną, 96-dołkową, przepuszczającą gaz membraną uszczelniającą.
9. Inkubować z wytrząsaniem z prędkością 200 obr./min, aby zapobiec osadzaniu się bakterii podczas inkubacji.

2. Mechaniczne rozbijanie pojedynczych robaków w formacie 96-dołkowym

NUTA: W tej sekcji opisano protokół formatu 96-dołkowej płytki do mechanicznego rozbijania pojedynczych skolonizowanych bakteryjnie C. elegans. Pierwsze kroki w protokole opisują metodę usuwania nieprzylegających bakterii z jelita robaka i czyszczenia zewnętrznej części robaków za pomocą zimnego paraliżu i wybielania powierzchniowego. Etapy te pozwolą na wytworzenie czystych, żywych dorosłych robaków, które mogą zostać mechanicznie rozbite w celu ilościowego określenia zawartości bakterii lub wykorzystane do dalszych eksperymentów. Protokół ten można dostosować do ilościowego oznaczania bakterii u robaków skolonizowanych w płynnej kulturze, na płytkach agarowych lub z gleby naturalnej lub mikrokosmicznej.

1. Umieścić podwielokrotność M9TX-01 na lodzie do schłodzenia (4-5 razy więcej niż liczba próbek w ml).
2. Przygotować porcję M9TX-01 + wybielacz (6% podchlorynu sodu, 1:1000 lub 1:2000 v/v, 1 ml na próbkę + 1 ml ekstra) i umieścić na lodzie do schłodzenia.
3. Zawiesić każdą próbkę robaka w 1 ml M9TX-01 w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
4. Krótko zawiruj probówki (2-3 s) w miniwirówce wolnoobrotowej (2 000 x g) w temperaturze 25 °C, aby granulować dorosłe osobniki. Odpipetować sklaraty sklarowanej nad osadem i wyrzucić, uważając, aby nie naruszyć osadu robaka.
5. Za pomocą wirowania przepłucz robaki dwukrotnie 1 ml M9TX-01, a następnie raz 1 ml buforu robaka M9, aby zredukować bakterie zewnętrzne.
6. Usuń nieprzylegające bakterie z jelita robaka.
   1. Ponownie zawiesić każdą próbkę robaków w 1 ml pożywki S + 2x zabity termicznie OP50 w probówce hodowlanej.
   2. Inkubować w temperaturze 25 °C przez 20-30 minut, aby umożliwić przejście wszelkich nieprzylegających bakterii z jelit.
      NUTA: Spowoduje to również usunięcie wszelkich zewnątrzkomórkowych białek fluorescencyjnych ze światła i umożliwi wyraźniejszą wizualizację znakowanych bakterii przylegających do nabłonka jelitowego, szczególnie w przypadku stosowania fluoroforów kwasoodpornych (np. mCherry, dsRed).
7. Powierzchniowe robaki wybielające w celu usunięcia bakterii zewnętrznych.
   1. Oczyszczone robaki przepłukać dwukrotnie 1 ml zimnego M9TX-01 i wyrzucić supernatant.
   2. Pozostaw probówki do schłodzenia przez 10 minut na lodzie (preferowane) lub w temperaturze 4 °C. Sparaliżuje to robaki i zapobiegnie połknięciu wybielacza.
      NUTA: Inne protokoły wykorzystują chemiczny środek paraliżujący, taki jak lewamizol; Jest to uznane podejście, które wymaga dodania strumienia odpadów niebezpiecznych.
   3. Dodaj 1 ml lodowatego buforu robaka M9 + bezzapachowy wybielacz (8,25% wodorotlenku sodu, 1:1000 lub 1:2000 v/v) do każdej probówki. Pozostawić probówki na lodzie (preferowane) lub w temperaturze 4 °C przez co najmniej 10 minut, aby zabić bakterie zewnętrzne.
      NUTA: Nie przekraczać stężenia wybielacza 1:1000. Nawet u sparaliżowanych robaków może dojść do śmiertelności.
   4. Odpipetować bufor wybielacza i wyrzucić; Włóż probówki z powrotem do lodu, aby upewnić się, że robaki nie wznowią pompowania, dopóki wybielacz nie zostanie usunięty.
   5. Dodaj 1 ml zimnego M9TX-01 do każdej probówki. Wirować przez ~5 s w miniwirówce (2 000 x g w temperaturze 25 °C); Zwróć rurki do lodu. Usunąć supernatant i wyrzucić.
   6. Powtórz ten etap płukania z kolejnym 1 ml zimnego M9TX-01, odrzucając jak najwięcej supernatantu.

Materiały