Mechaniczne zakłócenia poszczególnych robaków w celu oceny zmienności interakcji gospodarz-bakteria

Streszczenie

Źródło: Taylor, M. N. i wsp. Wykorzystanie danych dotyczących pojedynczego robaka do ilościowego określenia niejednorodności interakcji Caenorhabditis elegans z bakteriami. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film pokazuje ilościowe określenie zmienności obciążenia bakteryjnego jelit u poszczególnych Caenorhabditis elegans poprzez zakłócenia mechaniczne. Przedstawiono w nim etapy przygotowania próbki, rozerwania mechanicznego, seryjnego rozcieńczania i zliczania kolonii w celu oceny różnic w obciążeniu bakteryjnym jelit między poszczególnymi robakami.

Protokół

1. Oddziel robaki w głębokiej 96-dołkowej płytce z ziarnem z węglika krzemu, aby zapobiec mechanicznym zakłóceniom. Przygotuj 96-dołkową płytkę zakłócającą w następujący sposób.
   1. Zaopatrzyć się w sterylną 96-dołkową płytkę o pojemności 2 ml i dopasowaną silikonową pokrywę płytki 96-dołkowej.
      NUTA: Ważne jest, aby używać płytek, które są kompatybilne z 96-dołkowymi adapterami do substancji zaburzających tkanki. Niewielkie różnice w wymiarach zewnętrznych decydują o różnicy między płytą, którą można wyjąć z adapterów, a tą, której nie można wyjąć.
   2. Za pomocą sterylnej szpatułki dodaj niewielką ilość sterylnego węglika krzemu o ziarnistości 36 do każdego dołka płytki, do którego zostanie wysłany robak. Użyj wystarczającej ilości ziarna, aby ledwo przykryć dno studzienki (około 0,2 g na studzienkę). Nadmiar materiału utrudni dołożenie końcówki pipety na dno studzienki podczas pobierania zawartości.
   3. Dodać 180 μl buforu robaka M9 do każdej studzienki.
   4. Oznacz kolumny lub wiersze, aby wskazać, gdzie trafi każda próbka, a następnie luźno przykryj płytkę silikonową osłoną płytki 96-dołkowej.
2. Przenieś pojedyncze robaki na 96-dołkową płytkę w celu zakłócenia.
   1. Ostrożnie przenieś przepuszczalne robaki na małą (35 lub 60 mm) szalkę Petriego zawierającą wystarczającą ilość bufora robaków M9 uzupełnionego 0,01% Triton X-100 (M9TX-01), aby napełnić szalkę na głębokość ~1 cm.
      NUTA: Jeśli obecna jest duża liczba robaków, przeniesienie całej próbki może nie być wykonalne, ponieważ ciecz stanie się zatłoczona i trudno będzie pipetować pojedyncze robaki.
   2. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego lub innego urządzenia o małym powiększeniu odpipetować pojedyncze robaki o objętości 20 μl i przenieść je do indywidualnych dołków na 96-dołkowej płytce.
      NUTA: Najlepiej zbierać tylko świeżo zabite robaki. Unikaj robaków o sztywnym, liniowym kształcie, ponieważ robaki te mogły być martwe od jakiegoś czasu. Spróbuj wziąć robaki, które są zakrzywione lub w kształcie litery S, z normalną fizjologią i nienaruszonym jelitem.
   3. Po przeniesieniu każdego woluminu upewnij się, że wybrany robak został rzeczywiście wyrzucony do studni. W tym celu należy odpipetować 20 μl M9TX-01 z czystego obszaru szalki Petriego i uwolnić całą objętość z powrotem do szalki; Spowoduje to zwykle wysunięcie robaka, jeśli przyklei się do pipety. Jeśli robak utknął, usuń 20 μl ze studzienki i spróbuj ponownie przenieść.
   4. Po przeniesieniu wszystkich robaków przykryj 96-dołkową płytkę arkuszem dostępnej w handlu elastycznej folii uszczelniającej na podłożu papierowym (2 x 2 kwadraty), upewniając się, że strona folii uszczelniającej na podłożu papierowym jest skierowana w dół na dołki na próbki. Uważaj, aby nie rozciągnąć folii uszczelniającej zbyt cienko, ponieważ później bardzo trudno będzie ją usunąć.
   5. Delikatnie umieść silikonową matę uszczelniającą na elastycznej folii uszczelniającej; W tym momencie nie wciskaj pokrywy do studzienek.
   6. Przenieś płytkę do 4 °C, aby schłodzić się przez 30-60 minut. Zapobiegnie to przegrzaniu podczas zakłóceń, które może uszkodzić próbki.
      NUTA: Jest to punkt przerwania w protokole. W większości przypadków płytkę można pozostawić w temperaturze 4°C do 4 godzin przed mieleniem. Nie zostawiaj robaków na noc, ponieważ zmieni to liczbę bakterii.
3. Załaduj 96-dołkowe płytki na urządzenie zakłócające tkanki, aby rozbić tkanki robaków i uwolnić bakterie jelitowe.
   UWAGA: (Opcjonalnie) W przypadku używania nieparzystej liczby płytek 96-dołkowych do trawienia, przed kontynuowaniem konieczne jest przygotowanie przeciwwagi. Użyj pustej, głębokiej płytki 96-dołkowej i napełnij studzienki wodą, aż będzie ważyć tyle samo, co pierwsza płytka.
   1. Mocno dociśnij silikonową matę uszczelniającą do dołków, aby uzyskać uszczelnienie, upewniając się, że pokrywka leży płasko na całej powierzchni płytki.
      NUTA: Jeśli elastyczna folia uszczelniająca jest zbyt gruba po rozciągnięciu, trudno będzie zabezpieczyć silikonową pokrywę tak, aby leżała płasko we wszystkich studzienkach. Spowoduje to niewystarczające uszczelnienie i zanieczyszczenie od źródła do studzienki podczas wytrząsania.
   2. Zabezpiecz płytki w urządzeniu zaburzającym tkanki za pomocą adapterów do płytek 96-dołkowych. Potrząsaj płytkami przez 1 minutę przy 30 Hz, następnie obróć płytki o 180° i ponownie potrząsaj przez 1 minutę. Pomoże to zapewnić równomierne zakłócenie we wszystkich dołkach płyty.
   3. Mocno postukaj płytkami o stół dwa lub trzy razy, aby usunąć piasek z elastycznej folii uszczelniającej.
   4. Używając dużej wirówki z dwoma adapterami płytek 96-dołkowych, obracaj płytki w dół przy 2400 x g przez 2 minuty, aby zebrać cały materiał na dno studzienek.
   5. Zdejmij silikonową pokrywę i ostrożnie zdejmij elastyczną folię uszczelniającą.
      NUTA: Jeśli elastyczna folia uszczelniająca przyklei się do którejkolwiek ze studzienek, użyj końcówki pipety o pojemności 200 μl, aby ją usunąć. Dzieje się tak często, gdy elastyczna folia uszczelniająca jest zbyt cienka i rozciągnięta.
4. Seryjnie rozcieńczone próbki trawione przez robaki w 300 μl na płytkach 96-dołkowych.
   1. Używając pipety wielodołkowej ustawionej na 200 μl, kilkakrotnie powoli i ostrożnie pipetować w górę i w dół, aby ponownie wymieszać zawartość studzienek, a następnie odciągnąć jak najwięcej płynu. Przenieść tę ciecz do górnych rzędów 96-dołkowych płytek przygotowanych do seryjnego rozcieńczania uszkodzonych próbek robaków.
   2. Używając pipety 96-dołkowej ustawionej na 20 μl, usuń tę objętość płynu z górnego rzędu i dozuj do rzędu B. Pipetuj w górę i w dół 8-10 razy, aby wymieszać. Odrzuć końcówki.
   3. Powtórzyć krok 4.2, zaczynając od 0,1 x próbki w wierszu B, aby utworzyć 0,01x próbki rozcieńczone w wierszu C.
   4. Powtórz ponownie krok 4.2, przechodząc od rzędu C do rzędu D.
   5. Płytkę na stałym agarze w celu ilościowego określenia ilości bakterii. W przypadku robaków skolonizowanych monokolonizacją na ogół wystarcza umieszczenie 10-20 μl kropli z każdego rozcieńczenia [1x-0,001x] na płytkach agarowych. W przypadku kolonizacji wielogatunkowej każde rozcieńczenie należy rozcieńczyć oddzielnie, pipetując 100 μl na płytkę agarową o średnicy 10 cm; Natychmiast rozprowadź za pomocą szklanych koralików.

Materiały