$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Kwantyfikacja lokalizacji biegunowej i dynamiki składowych Dot/ICM
NUTA: Poniższe kroki są przeznaczone dla obrazów o rozdzielczości 0,129 μm na piksel, które zostały uzyskane przy użyciu łączenia w grupy 2 x 2.
- Kwantyfikacja polarności białek fuzyjnych sfGFP (superfolder green fluorescent protein) (ryc. 1)
- Dostosuj kontrast obrazu, aby bakterie były wyraźnie widoczne. Użyj narzędzia Region, aby umieścić prostokąt o wymiarach 0,25 x 1,3μm2 , zaczynając od bieguna i rozciągając się do cytoplazmy. Prostokąt musi dokładnie znajdować się w granicach bakterii.
- Zaznacz co najmniej 200 bakterii i użyj przycisku Region do maskowania , aby utworzyć maski dla interesujących regionów. W obszarze Statystyka maski i Zakres maski wybierz pozycję Obiekt. Następnie w obszarze Cechy i intensywność zaznacz Średnia intensywność i wariancja.
- Wyeksportuj dane i oblicz wyniki polaryzacji każdej bakterii jako stosunek wariancji do średniej intensywności.
- W przypadku zastosowań o wysokiej przepustowości należy użyć obiektywu fazowego i odpowiedniej konfiguracji kondensora do uzyskiwania obrazów z kanałami fazowymi i 488 nm. Upewnij się, że wybierasz pola widzenia, w których bakterie są całkowicie oddzielone.
- Dostosuj kontrast kanału fazowego obrazu do poziomu, w którym bakterie są wyraźnie widoczne. Otwórz obraz dwukanałowy, uruchom okno Utwórz maskę segmentu i zmień kanał na fazowy.
- Dostosuj odpowiedni próg i usuń małe obiekty za pomocą przycisku Zdefiniuj obiekty . W obszarze Popraw maskę wybierz opcję Usuń obiekty krawędzi, a następnie oddziel maski bakterii, które sąsiadują ze sobą.
- Oblicz wyniki polaryzacji sygnału w kanale 488 dla każdej komórki, jak opisano wcześniej w krokach 1.1.2–1.1.3.
- Kwantyfikacja dynamiki białek fuzyjnych sfGFP (ryc. 2)
NUTA: Dynamika jest definiowana jako zmiany intensywności w czasie, a poniższe kroki są zaprojektowane dla krótkich okresów obrazowania (tj. kilku minut). Dodaj do wkładki odpowiednie suplementy, jeśli pożądane są dłuższe okresy obrazowania.- W oknie Image Capture (Przechwytywanie obrazu ) zaznacz Timelapse, wprowadź czas interwałów w polu interwału i wprowadź 2 w polu # punktów czasu . Uzyskaj dwa kolejne obrazy Legionella pneumophila wyrażające interesujące nas białko fluorescencyjne.
- Dostosuj kontrast obrazu, aż komórki będą wyraźnie widoczne. Postępuj zgodnie z rysunkiem 2A i poniższymi opisami, aby umieścić trzy różne maski. Użyj narzędzia Region, aby umieścić kwadrat o wymiarach 0,25 x 0,25 μm pośrodku co najmniej 400 komórek.
- Użyj przycisku Region to Mask , aby utworzyć maskę (maskę 1) interesujących kwadratów. Utwórz nową pustą maskę (maskę 2) i użyj narzędzia Piksel lub narzędzia Wielokąt, aby zaznaczyć cały obszar komórek z co najmniej 25 losowych komórek, które zostaną użyte do obliczenia wybielania fluorescencyjnego. Utwórz nową pustą maskę (maskę 3) i użyj dużego narzędzia pędzla, aby zaznaczyć obszary między komórkami, które zostaną użyte do odejmowania tła.
- W obszarze Statystyka maski i Zakres maski wybierz opcję Obiekt dla maski 1 i maski 2. Następnie w obszarze Cechy i intensywność wybierz opcję Średnia intensywność i wyeksportuj dane dwóch masek. W przypadku maski 3 wyeksportuj średnią intensywność całej maski.
- Oblicz zmianę intensywności fluorescencji dla każdego obiektu w masce 1, korzystając z następujących wzorów:
Gdzie maska 1 to kwadrat o wymiarach 0,25 μm × 0,25 μm umieszczony w środku komórki, maska 2 obejmuje całą komórkę, maska 3 to tło między komórkami, T1 to średnia intensywność w pierwszym punkcie czasowym, a T2 to średnia intensywność w drugim punkcie czasowym.
