Hodowla szybko rozwijającej się bakterii Vibrio natriegens

Streszczenie

Źródło: Wiegand, D. J., Lee i in., Ekspresja białek bez komórek przy użyciu szybko rosnącej bakterii Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (2019)

Ten film pokazuje uprawę i zbiór Vibrio natriegens, szybko rosnącej bakterii, w napowietrzanych warunkach w celu przygotowania granulek bakteryjnych do wytwarzania surowego ekstraktu.

Protokół

Przygotowanie ekstraktu z komórek surowych Vibrio natriegens – kultura bakteryjna

1. Przygotować pożywkę do wzrostu bakterii V. natriegens LB-V2 (bulion lizogeniczny z solami V2) zgodnie z tabelą 1. Wysterylizuj pożywkę wzrostową przez autoklawowanie. Poczekaj, aż nośnik osiągnie temperaturę pokojową (RT). Przechowuj nadmiar nośników w RT.
   OSTROŻNOŚĆ: Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) i zapoznać się z instrukcjami obowiązującymi w laboratorium podczas obsługi autoklawu.
2. Użyj glicerolu z V. natriegens typu dzikiego, aby zaszczepić 3 ml pożywki LB-V2. Rosnąć przez noc w temperaturze 30 °C, wstrząsając z prędkością 225 obr./min.
3. Przemyć 1 ml nocnej kultury przez odwirowanie przy 10 600 x g na wirówce stołowej przez 1 minutę. Odessać supernatant bez naruszania powstałego osadu i ponownie zawiesić w 1 ml świeżej pożywki LB-V2.
4. Do autoklawowanej 4-litrowej kolby Erlenmeyera z przegrodą i sterylną pokrywą dodać 1 l świeżej pożywki wzrostowej LB-V2. Zaszczepić przy użyciu 1 ml przemytej kultury przez noc (stosunek rozcieńczenia 1:1,000). Uprawiaj kulturę w temperaturze 30 °C, wytrząsając z prędkością 225 obr./min.
   UWAGA: Kultury V. natriegens można skalować w górę lub w dół, zachowując stosunek rozcieńczenia 1:1,000. Na przykład, dodać 250 μl przemytej kultury przez noc do 250 ml świeżej pożywki wzrostowej LB-V2 w 2-litrowej kolbie Erlenmeyera z przegrodą o pojemności 2 litrów ze sterylną pokrywą.
5. Monitorować OD₆₀₀ w kulturze za pomocą spektrofotometru. Gdy kultura osiągnie OD₆₀₀ = 1,0 ± 0,2, zebrać kulturę przez odwirowanie przy 3 500 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Umieścić granulat na lodzie.
   UWAGA: V. natriegens rośnie szybko, dlatego konieczne jest ścisłe monitorowanie kultury. Wzrost do OD₆₀₀ = 1,0 powinien zająć około 1,5-2 h przy stosunku rozcieńczenia 1:1,000.
6. Odessać supernatant i natychmiast przechowywać powstały osad bakteryjny w temperaturze -80 °C lub bezpośrednio przystąpić do lizy komórek.
   NUTA: Ten krok jest dobrym punktem zatrzymania; Zaleca się jednak, aby pelety zostały przetworzone natychmiast lub w ciągu 1-2 dni, aby uzyskać najlepsze wyniki.

Tabela 1: Odczynniki do przygotowania 1 l bakteryjnej pożywki rozwojowej LB-V2

Tabela 1 A	Przygotowanie pożywki do hodowli bakterii LB-V2
Składnik	Ilość (g)	Stężenie końcowe (mM)	Objętość końcowa (L)
Rosół LB (młynarz)	25		1
Zawartość NaCl	11.69	200
MgCl2	2.20	23.1
Kcl	0.31	4.2
Tabela 1 B	Przygotowanie buforu do lizy S30A
Składnik	Ilość (g)	Stężenie końcowe (mM)	Objętość końcowa (L)
Roztwór Tris (pH 8,0) - 1 M (mL)	25	50	0.5
Mg-glutaminian	2.72	14
K-glutaminian	6.10	60
Ditionotreitol (DTT) - 1 M (ml)	1	2

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówki 2 ml	Eppendorf powiedział:	22363352
HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy)	Sigma	H3375 powiedział:
LB (Luria-Bertani) Rosół (młynarz)	Sigma	L3522
Chlorek magnezu (MgCl₂)	Sigma	Zobacz materiał M8266
Chlorek potasu (KCl)	Sigma	Zobacz materiał P9333 powiedział:
Chlorek sodu (NaCl)	Sigma	Zobacz materiał S7653
Roztwór Tris (pH 8,0) - 1 m	Invitrogen	Zobacz materiał AM9856
Vibrio natriegens (typ dziki) Liofilizowany materiał	Kontroler ATCC (Kontroler T	14048