Ten film demonstruje zastosowanie bakteryjnego, bezkomórkowego systemu ekspresji białek opartego na surowym lizacie Vibrio natriegens do przeprowadzenia sprzężonej transkrypcji i translacji in vitro. Skupia się na przygotowaniu głównej mieszanki z niezbędnymi składnikami i stopniowej syntezie funkcjonalnych białek z matrycy DNA.
1. Przygotowanie bezkomórkowych składników reakcji
Ogólne składniki reakcji
Przygotować zapasy robocze Mg-glutaminianu i K-glutaminianu w probówkach o pojemności 50 ml ze sterylną wodą DI (dejonizowaną) o stężeniach odpowiednio 100 mM i 2000 mM.
Przygotować zapas roboczy z 50% (w/v) glikolu polietylenowego (PEG)-8000, dodając 100 ml sterylnej wody demineralizowanej do zlewki o pojemności 250 ml. Umieść małe mieszadło magnetyczne w zlewce. Odważyć 50 g PEG-8000 i dodać do 100 ml wody w zlewce.
Umieścić zlewkę na rozgrzanej płytce mieszającej ustawionej na 100 °C i mieszać z prędkością 250 obr./min, aż PEG-8000 znajdzie się w roztworze. Poczekaj, aż płynna mieszanina PEG-8000 ostygnie przed przelaniem do probówek o pojemności 50 ml.
Główny miks rozwiązań energetycznych
Przygotować 5 M roztwór KOH, dodając 140 g granulek KOH do 500 ml sterylnej wody DI. OSTROŻNOŚĆ: Przygotuj ten roztwór w kapturze chemicznym i noś środki ochrony osobistej podczas pracy z mocnymi zasadami. Roztwór stanie się gorący, więc nakrętka butelki musi być luźna, aby zapobiec wzrostowi ciśnienia. Przed użyciem poczekaj, aż roztwór KOH dotrze do RT.
Przygotuj bufor 1750 mM HEPES-KOH, dodając 20,85 g HEPES do butelki o pojemności 100 ml. Powoli dodawaj sterylną wodę DI, aż objętość osiągnie 40 ml. Butelka Vortex do rozpuszczenia HEPES. Użyj 5 M roztworu KOH, aby dostosować pH do 8,0, a następnie doprowadzić objętość roztworu do 50 ml. OSTROŻNOŚĆ: Z KOH należy obchodzić się przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej podczas regulacji pH.
Przygotować pozostałe 10 składników podstawowych mieszanki energetycznej w stężeniach wskazanych w tabeli 1 w sterylnej wodzie demineralizowanej i umieścić każdy bulion na lodzie. Rozmrozić 100 mln zapasów ATP, GTP, CTP i UTP w temperaturze pokojowej i umieścić na lodzie. NUTA: W razie potrzeby można użyć termomiksera ustawionego na 37 °C i 350 obr./min do rozpuszczenia odczynników w roztworze. Nie przegrzewaj ani nie pozostawiaj odczynników na termomikserze przez dłuższy czas.
Do probówki o pojemności 15 ml dodać każdy składnik mieszanki głównej roztworu energetycznego zgodnie z kolejnością i objętością określonymi w tabeli 1. Zmieszaj roztwór po dodaniu każdego składnika. Pozwoli to uzyskać 5 ml 10-krotnej mieszanki głównej roztworu energetycznego.
Podzielić 10-krotną mieszankę wzorcową roztworu energetycznego na 200 μl porcji w probówkach o pojemności 2 ml. Błyskawiczne zamrożenie każdej podwielokrotności. Natychmiast umieść je w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
Główna mieszanka aminokwasów
Aby przygotować świeżą mieszankę 4x aminokwasów głównych, zacznij od rozmrożenia każdego zapasu aminokwasów w temperaturze pokojowej, a następnie umieść je na lodzie. Użyj wirownika i/lub termomiksera ustawionego na 37 °C i 350 obr./min, aby upewnić się, że wszystkie zapasy aminokwasów są całkowicie rozpuszczone. NUTA: Cysteina może nie rozpuścić się całkowicie; Może być dodawany do głównej mieszanki aminokwasów w postaci zawiesiny. Nie przegrzewaj ani nie pozostawiaj odczynników na termomikserze przez dłuższy czas.
W probówce o pojemności 15 ml dodaj odpowiednią objętość aminokwasów do sterylnej wody DI, tak aby końcowe stężenie każdego z nich wynosiło 8 mM w następującej kolejności: ALA, ARG, ASN, ASP, GLN, GLU, GLY, HIS, IIE, LYS, MET, PHE, PRO, SER, THR, VAL, TRP, TYR, LEU i CYS. Po dodaniu każdego aminokwasu zmieszaj roztwór mieszanki głównej. Objętości wymienione w Tabeli 1 będą stanowić 2,4 ml głównej mieszanki aminokwasów.
Podzielić 4x główną mieszankę aminokwasów na 200 μl porcji w probówkach o pojemności 2 ml. Błyskawiczne zamrożenie każdej podwielokrotności. Natychmiast umieścić w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
Wytwarzanie gotowej do reakcji matrycy DNA plazmidu NUTA: Ekspresja białek bezkomórkowych w tym systemie została zoptymalizowana przy użyciu wektora ekspresji białka zielonej fluorescencji (GFP) T7-pJL1-sfGFP (Tabela materiałów). Zaleca się stosowanie tego plazmidu jako kontroli wydajności reakcji bezkomórkowej oraz szkieletu pJL1 do klonowania i ekspresji innych sekwencji białkowych. Można użyć innych plazmidowych matryc DNA; jednak ważne jest, aby pamiętać, że transkrypcja jest kontrolowana przez sekwencję promotora T7 i obecność polimerazy RNA T7. Prosty protokół produkcji na dużą skalę dowolnej matrycy plazmidowego DNA z przekształconej E. coli opisano poniżej.
Oczyść żądany wektor za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu zgodnie z instrukcjami producenta (tabela materiałów). UWAGA: Zaleca się maksymalne zagęszczenie matrycy DNA plazmidu, aby spełnić ścisłe ograniczenia objętościowe reakcji bezkomórkowej. Ogólnie rzecz biorąc, należy dążyć do zapasu roboczego o pojemności 750−1500 ng/μl.
2. Przeprowadzanie bezkomórkowych reakcji ekspresji białek przy użyciu surowego ekstraktuV. natriegens
Bezkomórkowa ekspresja białek przy użyciu plazmidu lub liniowej matrycy DNA
Wyjmij 10 porcji głównej mieszanki roztworu energetycznego i 4 porcje głównej mieszanki aminokwasów z zamrażarki -80 °C, rozmrozić w temperaturze pokojowej i umieścić na lodzie. Wyjmij zapasy polimerazy RNA T7 i inhibitora RNazy z zamrażarki w temperaturze -20 °C i umieść je na lodzie. Rozmrozić matrycę DNA w RT i umieścić na lodzie.
Przygotować bezkomórkową mieszankę wzorcową reakcji zgodnie z tabelą 2 , dodając każdy składnik w następującej kolejności do probówki o pojemności 2 ml na lodzie: główna mieszanka aminokwasów, główna mieszanina roztworu energetycznego, Mg-glutaminian, K-glutaminian, matryca DNA, PEG-8000, polimeraza RNA T7 i inhibitor RNazy. Delikatnie przesuwaj probówkę po każdym dodaniu do mieszanki wzorcowej. NUTA: Jeśli matryca liniowa ma być użyta do ekspresji białka bez komórek, dodaj 5-10 razy więcej materiału w porównaniu z matrycą plazmidu, aby uzyskać znaczne plony białka.
Usunąć surowy lizat komórkowy V. natriegens z zamrażarki w temperaturze -80 °C i umieścić na lodzie na 10-20 minut do rozmrożenia. Dodać odpowiednią objętość surowego ekstraktu komórkowego do bezkomórkowej mieszanki wzorcowej reakcji, zgodnie z tabelą 2 i delikatnie wymieszać, przesuwając lub pipetując w górę i w dół.
Końcowa ekspresja białka bezkomórkowego za pomocą termocyklera
Odpipetować 10 μl bezkomórkowej mieszaniny wzorcowej reakcji na dno 96- lub 384-dołkowej płytki do PCR. Pomiędzy każdym przeniesieniem na płytkę PCR wymieszaj mieszankę główną, delikatnie przesuwając probówkę. NUTA: Bezkomórkowa mieszanka wzorcowa reakcji powinna być dobrze wymieszana przez cały czas, aby zmaksymalizować odtwarzalność reakcji i ekspresję białka bezkomórkowego we wszystkich próbkach.
Krótko odwirować płytkę o stężeniu 1 000 x g przez 10 sekund, aby zebrać wszelkie mieszanki wzorcowe, które mogły utknąć po bokach studzienek. Uszczelnij studzienki klejem do płytek, aby zapobiec parowaniu, a następnie umieść płytkę PCR w termocyklerze ustawionym na 26 °C z podgrzewaną pokrywką ustawioną na 105 °C. NUTA: Równomierne rozprowadzanie ciepła i podgrzewana pokrywa termocyklera znacznie poprawiają wydajność ekspresji białka.
Inkubować reakcje bezkomórkowe przez co najmniej 3 godziny. Po inkubacji ekspresje białek można oczyścić, określić ilościowo i wykorzystać w dalszych procesach. NUTA: Ekspresję białek można bezpośrednio określić ilościowo w reakcji bezkomórkowej przy użyciu metody wybranej przez użytkownika. Na przykład białka fluorescencyjne można określić ilościowo za pomocą zewnętrznej krzywej wzorcowej lub radioaktywność można zmierzyć, jeśli używa się aminokwasu znakowanego radioaktywnie w reakcji bezkomórkowej. Spektroskopia w zakresie widzialnym w promieniowaniu UV lub testy białka całkowitego generalnie nie są zalecane do bezpośredniego pomiaru produkcji białek w reakcjach bezkomórkowych bez wstępnego oczyszczenia.
Tabela 1: Odczynniki do przygotowania 5 ml 10 ml głównej mieszanki roztworu energetycznego i 2,4 ml 4 ml głównej mieszanki aminokwasów.