Monitorowanie wzrostu bakterii w czasie rzeczywistym za pomocą mikroprzepływowego systemu hodowli mikrokropelek

Streszczenie

Źródło: Jian, X. i wsp., Zautomatyzowana uprawa drobnoustrojów i ewolucja adaptacyjna przy użyciu systemu hodowli mikrodrobnoustrojów (MMC). J. Vis. Exp. (2022)

Ten film demonstruje wykorzystanie platformy mikroprzepływowej opartej na kropelkach do monitorowania wzrostu bakterii w czasie rzeczywistym. Generując jednorodne kropelki zawierające zawiesiny bakteryjne i prowadząc je przez ścieżkę detekcji, system umożliwia ciągły optyczny pomiar gęstości komórek w celu skonstruowania krzywej wzrostu.

Protokół

1. Przygotowania

1. Podłączyć igłę strzykawki (średnica wewnętrzna wynosi 0,41 mm, a średnica zewnętrzna 0,71 mm), szybkozłączkę A i butelkę z odczynnikiem (Rysunek 1C) i sterylizować je w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut.
   NUTA: Podczas sterylizacji lekko odkręć nakrętkę butelki z odczynnikiem. Za każdym razem można przygotować kilka dodatkowych butelek z odczynnikiem do użycia.
2. Użyj filtra z polifluorku winylidenu (PVDF) 0,22 μm, aby przefiltrować olej z systemu hodowli mikrokropelek (MMC). Umieść wcześniej chip mikroprzepływowy (rysunek 1B) i olej MMC w czystej ławce i sterylizuj je promieniowaniem ultrafioletowym przez 30 minut przed użyciem.
   NUTA: Szczegółowe informacje na temat szybkozłącza A, butelki z odczynnikiem, oleju MMC i chipa mikroprzepływowego można znaleźć w Tabeli materiałów.
3. Zainstaluj chip mikroprzepływowy
   1. Otwórz drzwi komory operacyjnej (rysunek 1A) i podnieś sondę światłowodową.
   2. Dopasuj otwory pola elektrycznego do igieł pola elektrycznego i delikatnie umieść chip na cokole chipa. Następnie włóż dwie kolumny pozycjonujące do otworów pozycjonujących i odłóż sondę światłowodową (rysunek 1D).
   3. Podłącz szybkozłącze A na chipie do odpowiedniego portu MMC zgodnie z numerem pozycji (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). Następnie zamknij drzwi komory operacyjnej.
4. Uzupełnij olej MMC (do około 80 ml) w butelce z olejem i opróżnij zużyty płyn z butelki na odpady przed użyciem.
   NUTA: Ciecz odpadowa to zwykle odpady organiczne. Po utylizacji należy zapoznać się z regionalnymi przepisami i regulacjami, które mogą ulec zmianie w zależności od konfiguracji eksperymentalnej.

2. Pomiar krzywej wzrostu w MMC

1. Przygotowanie do początkowego roztworu bakteryjnego
   1. Postępuj zgodnie z odpowiednimi normami, aby przygotować pożywkę Luria-Bertani (LB) i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121°C przez 15 minut.
      NUTA: Składniki pożywki LB: NaCl (10 g/L), ekstrakt drożdżowy (5 g/L) i trypton (10 g/L).
   2. Wyjąć szczep Escherichia coli (E. coli) MG1655 z wywaru glicerolowego i hodować go w kolbie do wytrząsania o pojemności 50 ml z 10 ml pożywki LB w inkubatorze do wytrząsania (200 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 5-8 godzin.
      NUTA: Czas uprawy zależy od konkretnych szczepów. Optymalna jest uprawa szczepu w okresie/fazie logarytmicznej.
   3. Rozcieńczyć wyhodowany roztwór E. coli MG1655 świeżą pożywką do gęstości optycznej 0,05-0,1 o długości 600 nanometrów (OD₆₀₀) w celu uzyskania początkowego roztworu bakteryjnego (przygotować około 10 ml).
2. Kliknij Inicjalizacja , aby zainicjować MMC. Po wyświetleniu interfejsu inicjalizacji ustaw temperaturę uprawy na 37 °C, a wartość sygnału fotoelektrycznego na 0,6 (Rysunek 2A). Inicjalizacja zajmie około 20 minut.
3. Włącz lampę ultrafioletową (UV) (długość fali 254 nm) podczas inicjalizacji.
4. Wstrzyknąć początkowy roztwór bakterii i olej MMC do butelki z odczynnikiem.
   1. Wyjmij wysterylizowaną butelkę z odczynnikiem na czystej ławie i dokręć nakrętkę.
   2. Za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 10 ml wstrzyknij 3-5 ml oleju MMC z igły strzykawki w bocznej tubce. Powoli przechylaj i obracaj butelkę z odczynnikiem, aby olej w pełni przeniknął do wewnętrznej ścianki.
   3. Wstrzyknij około 5 ml początkowego roztworu bakteryjnego, a następnie napełnij butelkę z odczynnikiem, ponownie wstrzykując 5-7 ml oleju.
   4. Wyciągnij niezależne szybkozłącze A i włóż szybkozłącze A butelki z odczynnikiem do szybkozłącza B, aby zakończyć operację wstrzykiwania próbki (Rysunek 3A).
5. Poczekaj na zakończenie inicjalizacji, a następnie wyłącz lampę UV (długość fali 254 nm).
6. Otwórz drzwi komory operacyjnej i włóż butelkę z odczynnikiem do metalowej kąpieli.
7. Wyciągnij złącze C2 chipa i szybkozłącze A butelki z odczynnikiem. Podłącz boczne złącze rurki butelki z odczynnikiem do złącza C2, a złącze górnej rurki do złącza O2. Następnie zamknij drzwi komory operacyjnej.
8. Kliknij na Krzywa wzrostu , aby wybrać funkcję pomiaru krzywej wzrostu (Rysunek 2A). W interfejsie ustawiania parametrów wprowadź liczbę jako 15, włącz przełącznik wykrywania OD i ustaw długość fali na 600 nm. Kliknij Start , aby rozpocząć generowanie kropel. Zajmie to około 10 minut. NUTA: W tym przypadku liczba odnosi się do liczby kropel, które mają zostać wygenerowane. Długość fali odnosi się do długości fali OD, która ma być wykryta. Ustaw liczbę (maksymalnie 200) i długość fali (350-800 nm) zgodnie z wymaganiami eksperymentu.
9. Gdy w głównym interfejsie pojawi się wyskakujące okienko z monitem "Wyjmij butelkę z odczynnikiem między C2 i O2, a następnie kliknij przycisk OK po zakończeniu", otwórz drzwi komory operacyjnej, aby wyjąć butelkę z odczynnikiem i podłączyć złącza C2 i O2.
10. Zamknij drzwi i kliknij przycisk OK w wyskakującym okienku, aby automatycznie wyhodować kropelki i wykryć wartości OD.
    NUTA: MMC wykrywa wartość OD, gdy kropla przechodzi przez sondę światłowodową. Dlatego okres wykrywania zależy od liczby generowanych kropel.
11. Gdy krzywa wzrostu osiągnie fazę stacjonarną, kliknij przycisk Eksport danych , aby wyeksportować dane OD. Wybierz ścieżkę zapisu danych i wyeksportuj wartość OD zarejestrowaną w okresie uprawy w formacie .csv, który można otworzyć za pomocą odpowiedniego oprogramowania (np. Microsoft Excel). Następnie użyj oprogramowania do mapowania (np. EXCEL i Origin 9.0), aby wykreślić krzywą wzrostu.
    NUTA: Podczas procesu uprawy możliwe jest kliknięcie Eksport danych w dowolnym momencie, aby wyeksportować dane OD wszystkich obecnych kropel.

Wyniki

Rysunek 1: Struktura i podstawowe narzędzia MMC. (A) Komora zewnętrzna i operacyjna MMC. (B) Chip mikroprzepływowy MMC. Układ posiada siedem kanałów (C1-C6 i CF). (C) Butelka z odczynnikiem. Posiada rurę górną i rurę boczną. Przed wstrzyknięciem próbki do...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Membrana filtracyjna PVDF 0,22 μm	Merck Millipore Sp. z o.o.	SLGPR33RB	Wysterylizuj olej MMC
Lodówka 4 °C	Haier powiedział:	BCD-289BSW	Do przechowywania odczynników
Agar	Becton, Dickinson i spółka	214010	Do przygotowania płyt pełnych
Czysta ławka	Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.	DL-CJ-INDII	Do pracy aseptycznej i sterylizacji UV
Komputer	Lenovo powiedział:	E450 powiedział:	Instalacja oprogramowania i sterowanie MMC
Inkubator do pracy w stałej temperaturze	Szanghaj qixin instrument naukowy co., LTD	LRH 250	Do uprawy mikrobiologicznej na podłożu stałym
Waga elektroniczna	OHAUS	Zobacz materiał AR 3130	Do ważenia odczynników
Rurka EP	Rybak termiczny	1,5 ml	Do zbierania kropelek
Rurka do zamrażania	Rybak termiczny	2,0 ml	Do zachowania szczepu
Glicerol	ODCZYNNIK OGÓLNY	G66258A	Do zachowania szczepu
Garnek do sterylizacji parowej pod wysokim ciśnieniem	SANYO Elektryczny	MLS3020	Do sterylizacji w autoklawie
System hodowli mikrokropelek drobnoustrojów (MMC)	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Sp. z o.o.	MMC-I	Wyznaczanie krzywej wzrostu i ewolucja adaptacyjna. Zapoznaj się z http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Układ mikroprzepływowy	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Sp. z o.o.	MMC-ALE-OD	Do różnych operacji kropelkowych. Zapoznaj się z http://www.tmaxtree.com/en/
Olej MMC	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Sp. z o.o.	MMC-M/S-OD	Faza olejowa dla mikrofluidyki kropelkowej. Zapoznaj się z http://www.tmaxtree.com/en/
Zawartość NaCl	ODCZYNNIK OGÓLNY	G81793J	Składnik podłoża LB
szalka Petriego	Corning Incorporated	90 mm	Do przygotowania podłoża stałego
Pipeta	Eppendorf powiedział:	2,5 μL, 10 μL, 100 μL, 1000 μL	Do pracy z cieczami
Szybkozłączka A	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Sp. z o.o.	—	Do połączenia każdego złącza. Zapoznaj się z http://www.tmaxtree.com/en/
Butelka z odczynnikiem	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Sp. z o.o.	Płytka PCB MMC	Pobieranie próbek i przechowywanie roztworu bakteryjnego i odczynników. Zapoznaj się z http://www.tmaxtree.com/en/
Wstrząśnij kolbą	Unia-Biotechnologia	50 ml	Do hodowli mikrobiologicznej
Inkubator z wytrząsaniem	Szanghaj Sukun Industrial Co., Ltd.	SKY-210 2B	Do hodowli mikrobiologicznej w kolbie wstrząsowej
Strzykawka	INSTRUKCJA MEDYCZNA JIANGSU ZHIYU CO., LTD	10 ml	Pobrać płyn i wstrzyknąć go do butelki z odczynnikiem
Igła do strzykawki	Sklep z narzędziami OUBEL	22 GB	Średnica wewnętrzna wynosi 0,41 mm, a średnica zewnętrzna 0,71 mm.
Trypton	Oxoid Sp. z o.o.	Zobacz materiał LP0042	Składnik podłoża LB
Lodówka niskotemperaturowa	SANYO Ultra-niski	MDF-U4086S	Do zachowania odkształceń (-80 °C)
Spektrofotometr UV–Vis	Firma General Electric	Ultrospec 3100 pro	Do pomiaru wartości średnicy zewnętrznej
Ekstrakt drożdżowy	Oxoid Sp. z o.o.	Zobacz materiał LP0021	Składnik podłoża LB