Naturalna przemiana i ekspresja GFP w nitkowatych Cyanobacterium Phormidium lacuna

Streszczenie

Źródło: Weber, N., et al., Naturalna transformacja, ekspresja białek i kriokonserwacja nitkowatego Cyanobacterium Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film opisuje procedurę przeprowadzania naturalnej transformacji w nitkowatych sinicach przy użyciu plazmidowego DNA w celu uzyskania stabilnej ekspresji GFP i oporności na antybiotyki poprzez rekombinację homologiczną.

Protokół

1. Naturalna przemiana i ekspresja GFP

NUTA: Transformacja opiera się na wektorze plazmidowym rozmnażanym w Escherichia coli (E. coli); pGEM-T lub pUC19 mogą być używane jako wektory szkieletowe. Przykłady wektorów ekspresji białka zielonej fluorescencji superfolderu (sfGFP) opisano w sekcji dotyczącej wyników reprezentatywnych.

1. Wszystkie kroki należy wykonywać przy użyciu sterylnego materiału w sterylnych warunkach laboratoryjnych (czysta ławka, sterylne szkło).
2. Zaszczepić 2 x 50 ml płynnej pożywki f/2 w dwóch kolbach o pojemności 250 ml z 2 x 1 ml włókien Phormidium lacuna (P. lacuna) z działającej kultury. Uprawiać w świetle białym (50 μmol ^{m-2 s-1}) pod mieszaniem (obrót poziomy, 50 obr./min) przez ~5 dni w temperaturze 25 °C.
3. Przygotuj ~200 μg wektora transformacji DNA za pomocą zestawu do przygotowania midi zgodnie z instrukcją producenta.
4. Homogenizować 100 ml zawiesiny komórek P. lacuna (patrz tabela materiałów) przy 10 000 obr./min przez 3 min. Zmierz OD przy 750 nm (żądana wartość = 0,35).
5. Odwirować zawiesinę komórkową przez 15 minut w stężeniu 6 000 × g. Usunąć sklarowany osad i zawiesić osad w 800 μl (całkowita objętość łącznie z pozostałą cieczą i włóknami) pozostałej cieczy i dodatkowym medium f/2⁺ .
6. Weź osiem płytek bacto-agar f/2⁺ (o średnicy 10 cm) zawierających 120 μg/ml kanamycyny. Odpipetować 10 μg DNA na środek każdej płytki agarowej. Natychmiast odpipetować 100 μl zawiesiny komórek do środka każdej płytki agarowej (na wierzchu DNA).
7. Trzymaj płytkę agarową bez pokrywki na czystej ławce, aby nadmiar płynu odparował. Zamknij płytkę i uprawiaj ją w białym świetle w temperaturze 25 °C przez 2 dni.
8. Rozprowadzić filamenty każdej płytki agarowej z pętlą inokulacyjną na kilku świeżych płytkach bakto-agarowych f/2⁺ zawierających 120 μg/ml kanamycyny. Hodować płytki w białym świetle w temperaturze 25 °C i regularnie sprawdzać kultury pod mikroskopem.
9. Zidentyfikuj żywe, przekształcone włókna po 7-28 dniach pod mikroskopem. Szukaj zdrowych, zielonych filamentów (Rysunek 1), które różnią się od innych filamentów. Jeśli te zielone włókna można zidentyfikować, przejdź do następnego kroku; W przeciwnym razie zachowaj talerz przez kolejne 7 dni.
10. Użyj kleszczy, aby przenieść te zidentyfikowane żywe włókna do 50 ml płynnej pożywki f/2⁺ z 250 μg/ml kanamycyny. Uprawiać w białym świetle w temperaturze 25 °C na wytrząsarce (obrót poziomy, 50 obr./min). Obserwuj wzrost przez okres do czterech tygodni.
11. Przenieś filamenty z powrotem do podłoża agarowego zawierającego 250 μg/ml kanamycyny i poczekaj, aż włókna wyrosną. Po kilku dniach przenieś pojedyncze filamenty na świeżą płytkę agarową o wyższym stężeniu kanamycyny, np. 500 μg/ml. Zachowaj oryginalną tabliczkę.
12. Upewnij się, że włókna rozmnażają się w wysokim stężeniu kanamycyny w płynnej kulturze lub na agarze . Ponownie zwiększ stężenie kanamycyny, aby przyspieszyć segregację. NUTA: Przekształcony P. lacuna rośnie w ilości do 10 000 μg/ml kanamycyny. Inne gatunki mogą nie tolerować tak wysokich stężeń.
13. W celu wyrażenia GFP: obserwuj pojedyncze włókna za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy powiększeniu obiektywu ustawionym na 40x lub 63x. Uchwyć obraz transmisyjny w jasnym polu i obraz fluorescencyjny. Użyj następujących ustawień dla GFP: pasmo przepustowe 470 nm dla wzbudzenia, pasmo przepustowe 525 nm dla emisji i rozdzielacz wiązki 495 nm, początkowy czas ekspozycji 500 ms.
14. Dostosuj czas ekspozycji, aby uzyskać wyraźne sygnały fluorescencji, unikając intensywności nasycenia. Spróbuj użyć tego samego ustawienia dla wszystkich próbek.
15. Ponieważ włókna typu dzikiego będą również wykazywać fluorescencję, uchwyć obrazy z tymi samymi ustawieniami, co powyżej dla tej fluorescencji tła.UWAGA: Szczep wyrażający GFP musi mieć wyższy sygnał; w przeciwnym razie nie wyraża GFP.
16. Na podstawie czasów naświetlania i intensywności pikseli obrazów fluorescencyjnych oblicz i porównaj zawartość GFP w różnych włóknach.

Wyniki

Rysunek 1. Włókna Phormidium lacuna 5 tygodni po przemianie. Zastosowano wektor ekspresji sfGFP pMH1; selekcja nastąpiła na pożywce f/2 ze 120 μg/ml kanamycyny. Zielonkawe włókna są odp...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bacto Agar	OttoNorwald	214010
Mikroskop fluorescencyjny ApoTome	Zeiss
Mikroskop fluorescencyjny Axio Imager 2	Zeiss
Kanamycyna	Sigma-Aldrich	25389-94-0
Mikroskop DM750	Zeiss
Zestaw do ekstrakcji plazmidu Midi NucleoBond Xtra Midi	Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG	REF740410,50
Źródło światła, świetlówka L18W/954 światło dzienne	Firma OSRAM		Hodowla sinic
Źródło światła, panel LED XL 6500K 140 W	Kwitnąca Gwiazda	N/A	Hodowla sinic
Polistyr szalki Petriego, 100 mm x 20 mm	Merck	Zobacz materiał P5606-400EA
szalki Petriego polistyren, 60 mm x 15 mm	Merck	P5481-500EA
Pipetman 100-1 000 μL	Gilson	Kod produktu: FA10006M
Pipetman 10-100 μL	Gilson	Kod produktu: FA10004M
Pipety plastikowe 10 mL, sterylne	Greiner	607107
Shaker Unimax 2010	Instrumenty Heidolpha		Do uprawy
Probówka plastikowa, sterylna, 50 ml	Greiner	227261
Cicha kruszarka Ultraturrax M	Instrumenty Heidolpha		Homogenizator
F/2+ medium ciekłe	f/2-średni, z 10-krotnie zwiększonym NaNO₃ i NaH₂PO₄ (0,88 mM NaNO₃, 36 μM NaH₂PO₄
F/2+-agar	3 % (m/v) agar baktowy, sztuczna woda morska, 0,1 % (v/v) roztwór pierwiastków śladowych, 0,05 % (v/v) roztwór witamin, 8,8 mM NaNO₃, 0,36 mM NaH₂PO₄