Wysokowydajny test fluorescencjonujący do badania interakcji mikroorganizmów z robakami

Streszczenie

Źródło: Ali, I., i in. Wysokoprzepustowe badania przesiewowe izolatów mikroorganizmów o wpływie na zdrowie Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2022)

Ten film prezentuje wysokowydajny test fluorescencyjny, mający na celu ocenę, jak bakterie jelitowe wpływają na odporność na stres u Caenorhabditis elegans. Śledząc niebieską fluorescencję z pękniętych granulek jelit, test ujawnia wcześniejsze sygnały śmierci u robaków narażonych na testowe bakterie.

Protokół

1. Bezetykietowe testowanie przetrwania Caenorhabditis elegans (C. elegans) – szok termiczny i test utleniający (Dni 13–14) (Dni 13–14)

1. Oceń etap rozwoju robaków. Gdy >90% robaków osiągnie L4, należy je zebrać do 10 mL sterylnego roztworu M9 w stożkowych probówkach o pojemności 15 mL.
2. Przemyj robaki dokładnie (co najmniej 4 razy), skręcając w dół przy 142xg przez 2 minuty w 4 °C, usuwając supernatant i dodając 10 ml świeżego, sterylnego M9 między każdym płukaniem, aby pozbyć się bakterii Escherichia coli OP50. Ponownie zawiesij pellet dżdżownicowy w 10 mL M9.
3. Przelej 50 μL roztworu robaka do rurki wiążącej na niskiej powierzchni zawierającej 950 μL M9. Po delikatnym wymieszaniu zawartości rurki, aby uniknąć sedymentacji robaków, szybko użyj zwilżonej końcówki pipety o niskim wiązaniu, aby przenieść 3-4 oddzielne krople po 10 μL na szklaną szkiełkę lub płytkę do wzrostu nicieni (NGM). Liczenie liczby robaków pod stereomikroskopem przy 16-krotnym powiększeniu. Uśrednij liczenie z 3-4 kropel i określ liczbę robaków na mikrolitr w roztworze robaków.
4. Dostosuj stężenie robaków w probówce 10 mL, aby osiągnąć ~120 robaków w 8 μL. Jeśli rozwiązanie przygotowane jest w kroku 1.2. nie jest wystarczająco skoncentrowany, należy zakręcić robaki w dół i usunąć M9, aby osiągnąć 120 robaków na 8 μL.
5. Przelej 8 μL roztworu robaka (~120 robaków) do każdego z dołków ośmiu wcześniej przygotowanych płyt NGM-agarozy z 96 dołkami, używając pipety wielokanałowej lub pipety powtarzającej. Pamiętaj o używaniu końcówek o niskiej retencji, aby ograniczyć utratę robaków. Może być także konieczne obcięcie końcówek końcówek, aby umożliwić duże dorosłe robaki i ograniczyć obciążenia mechaniczne dorosłych.
   NUTA: Test wymaga co najmniej 30 żywych, zdrowych robaków, aby działać niezawodnie, ale najlepiej sprawdza się przy około 100 robakach na dołek.
6. Inkubować robaka i 96-dołkowe płytki NGM-agarozy z nasionami bakterii w temperaturze 25 °C przez 36 godzin.
7. Sprawdź płytki między 12 a 24 godzinami, upewniając się, że robaki pozostają pełne przez cały czas. Jeśli konieczne jest ponowne karmienie, należy ponownie zawiesić bakterie w 96-dołkowej bakteryjnej płycie przechowywanej w temperaturze 15 °C i dodać do 10 μL odpowiedniego roztworu bakteryjnego do 96-dołkowych płytek NGM-agarozy, gdzie robaki są zagrożone głodzeniem, przed końcem 36-godzinnego okresu inkubacji (głodzone robaki dają znacznie inne rezultaty, To bardzo ważne).
   NUTA: Następujące kroki należy wykonać w 15. dniu. Przed rozpoczęciem badania może być konieczne zoptymalizowanie wysokości odczytu. Optymalne odczyty zostaną osiągnięte 20-50 μm powyżej dna otworu. Będzie to zależało od modelu czytnika tablic. Niektóre oferują możliwość skanowania Z, inne pozwalają na ręczne wprowadzanie wysokości. Ustaw optymalną wysokość na poziomie, na którym wykrywany jest najwyższy sygnał fluorescencji niebieskiej (365 nm/430 nm). Niektóre czytniki płytek mogą pracować na stałej wysokości zoptymalizowanej do testów komórek przylegających i nie są idealne do testów LFASS.
8. Po 36 godzinach należy wydać 30 μL M9 do każdego odwiertu płyty 96-dołowej.
   NUTA: W przypadku testów termicznych czytnik płyt musi osiągnąć wymaganą temperaturę do przeprowadzenia testu i może wymagać wcześniejszego włączenia. Obecny protokół stosuje 42 °C do maksymalizacji prędkości zabijania, ale podejście to dotyczy także innych temperatur powyżej 30 °C.
9. Przenieś robaki (około 20 μL) na płytę z 384 dołkami zgodnie z układem zestawu, używając końcówek o niskiej retencji (rozważ odcięcie końca końcówek, aby duże robaki mogły zmniejszyć obciążenie mechaniczne dla dorosłych robaków).
   NUTA: W niniejszym badaniu stosuje się dwa różne ustawienia czytnika płyt dla dwóch opisanych tutaj testów (naprężenie termiczne i naprężenie oksydacyjne), dlatego próbki przeznaczone do tych dwóch testów nie mogą być nakładane na tę samą płytkę z 384 dołkami.
10. Upewnij się, że czytniki tablic są prawidłowo skonfigurowane (Tabela 1).
11. Uzupełnij płytki z 384 dołami kolejną ilością M9, dążąc do końcowej objętości 60 μL na odwiert. Do testu termicznego dodaj 40 μL M9, a do stresu oksydacyjnego indukowanego przez tert-butylulokoksyd (t-BHP) 34 μL M9 w 6 μl t-BHP.
    1. Rozpocznij badanie w ciągu 2 minut od dodania t-BHP (idealnie, wszystkie robaki powinny być wystawione na działanie t-BHP jednocześnie, a czas rozdzielczości testu wynosi 2 minuty). Jeśli to nie jest możliwe, użyj timera do oszacowania czasu spędzonego na pipetowaniu t-BHP przed rozpoczęciem testu, aby umożliwić późniejszą korektę mediany czasu zgonu.
12. Zamknij talerze przezroczystą pokrywką. Zabezpiecz krawędzie płytek z 384 dołkami taśmą maskującą (przyklejając płytę i pokrywkę), upewniając się, że taśma nie przechodzi na pokrywkę ani pod nią. Przetnij taśmę między pokrywką a płytką w odstępach czasu skalpelem, aby umożliwić wymianę powietrza i zminimalizować parowanie podczas badania.
13. Włóż płytkę do czytnika tablic i rozpocznij przebieg. Celuj w wzbudzanie przy 365 nm i wykrywanie emisji przy 435 nm co 2 minuty przez 6-12 godzin (Tabela 1).
    NUTA: Zazwyczaj 6 h wystarcza na testy stresu termicznego 42 °C, a 8 h na testy stresu utleniającego 7% t-BHP.

Tabela 1: Ustawienia testów utleniającego i stresu cieplnego. Przykłady ustawień stosowanych do testów obciążenia utleniającego (A) i cieplnego (B) na czytnikach płyt fluorescencyjnych używanych w tym badaniu.

Materiały