Technika chromatografii powinowactwa do oczyszczania rekombinowanego białka bakteryjnego

Streszczenie

Źródło: Becker, B. i inni. Prosty test reporterowy oparty na fluorescencji do identyfikacji składników komórkowych niezbędnych do transportu łańcucha toksyny rycyny A (RTA) w drożdżach. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film demonstruje oczyszczanie rekombinowanego białka oznaczonego polisystydyną za pomocą chromatografii powinowactwa na bazie niklu. Określa kluczowe kroki, w tym lizę bakteryjną przez sonikację, klarowanie i filtrację lizatu oraz selektywne wiązanie i eluację docelowego białka za pomocą imidazolu.

Protokół

1. Oczyszczanie RTA oznaczonego Hisem za pomocą chromatografii powinowactwa

1. Komórki sonikowe na lodzie według następującego protokołu: 15 sekund impulsu (20 mikronów), 30 sekund przerwy. Powtórz ten krok pięć razy.
2. Lizat z ogniwa wirówkowego w stężeniu 21 000 x g i 4 °C przez 15 minut oraz filtrujący supernatant za pomocą sterylnego systemu filtra strzykawkowego (o rozmiarze porów 0,2 μm).
   NUTA: Osadki komórkowe z udanych próbek sonikowanych mają przezroczyste brzegi.
3. Użyj zautomatyzowanego systemu oczyszczania wyposażonego w kolumnę powinowactwa opartą na^Ni-2+ o pojemności 5 mL do oczyszczania frakcji RTA oznaczonej Hisem z sterylnie filtrowanego supernatantu E. coli. Ogólnie używaj prędkości elucii 1 mL/min i chłodzi cały system oczyszczania, aby zapobiec nieefektywnemu wiązaniu toksyn i utracie aktywności toksyn.
   NUTA: Parametry efektywnego oczyszczania RTA są wymienione w Tabeli 1.
   1. Krótko mówiąc, wyrównaj kolumnę powinowactwa z 20 mL bufora wiązania, aby usunąć bufor magazynowy. Nałóż sterylnie filtrowany supernatant na kolumnę afinitetową za pomocą strzykawki.
   2. Przemyj kolumnę 25-35 ml buforu wiążącego, aby usunąć niezwiązane białka z kolumny. Wykonuj proces mycia aż absorpcja UV na 280 nm zbliży się do początkowej wartości UV.
   3. Frakcja RTA wiązana elutem w 20-35 mL buforu elucijnego (500 mM imidazol, 500 mM NaCl, 20 mM KH₂PO₄, pH = 7,2) i trzyma próbkę na lodzie (rysunek 1A i rysunek 1B).
      NUTA: Eluacja ułamku RTA charakteryzuje się wzrostem absorpcji promieni UV. Prosimy pamiętać, aby zbierać wyłącznie tę frakcję, aby zapobiec zanieczyszczeniu białkami niespecyficznymi wiązanymi.

Tabela 1: Parametry stosowane do oczyszczania i odsalania opartego na kolumnach. Lista wszystkich istotnych ustawień kolumny (np. przepływ, stężenie bufora elucijnego, równowaga i czas trwania kroku płukania) oraz zmierzone parametry (np. przewodność lub absorpcja UV).

Parametr chromatografii powinowactwa
Parametry pomiarowe	UV (280 nm), stężenie buforu elution, przewodność
Ustawienia	Zmienna/jednostka	Wartość
Przepływ	mL/min	1
Maksymalne ciśnienie kolumnowe	Mpa	0.35
Długość fali	Nm	280 nm
Bufor wiązania	Pozycja pompy	A
Bufor elucijny	Pozycja pompy	B
Bufor elucijny koncentracji początkowej	%	0
Kompensacja objętości systemu	Ml	10
Równowaga kolumnowa	Ml	20
Podawanie próbki przez superloop/strzykawkę	Ml	Objętość lizatu komórkowego
Etap mycia	Ml	20-35
Etap elucii	Ml	20-35
Bufor elucijny koncentracji podczas elucii	%	100
Rekalibracja kolumny z 20% EtOH	Ml	50
Parametr odsalania
Parametry pomiarowe	UV (280 nm), przewodność
Ustawienia	Zmienna/jednostka	Wartość
Przepływ	mL/min	4
Maksymalne ciśnienie kolumnowe	Mpa	0.35
Długość fali	Nm	280 nm
Bufor wiązania	Pozycja pompy	A
Bufor elucijny	Pozycja pompy	B
Bufor elucijny koncentracji początkowej	%	0
Kompensacja objętości systemu	Ml	10
Równowaga kolumnowa	Ml	20
Podawanie próbki przez superloop/strzykawkę	Ml	Objętość lizatu komórkowego
Wtrysk buforu odsolonego (0,8 M sorbitol)	Ml	100
Rekalibracja kolumny z 20% EtOH	Ml	50

Wyniki

Rysunek 1: Reprezentatywne wyniki chromatografii powinowactwa i odsalania komórek E. coli zawierających pET-RTA(_His)6 lub kontroli wektora pustego. (A) Typowy wykres oczyszczania próbki ...

Materiały