Technika chromatografii powinowactwa do oczyszczania rekombinowanego białka bakteryjnego

Streszczenie

Źródło: Becker, B. i inni. Prosty test reporterowy oparty na fluorescencji do identyfikacji składników komórkowych niezbędnych do transportu łańcucha toksyny rycyny A (RTA) w drożdżach. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film demonstruje oczyszczanie rekombinowanego białka oznaczonego polisystydyną za pomocą chromatografii powinowactwa na bazie niklu. Określa kluczowe kroki, w tym lizę bakteryjną przez sonikację, klarowanie i filtrację lizatu oraz selektywne wiązanie i eluację docelowego białka za pomocą imidazolu.

Protokół

1. Oczyszczanie RTA oznaczonego Hisem za pomocą chromatografii powinowactwa

1. Komórki sonikowe na lodzie według następującego protokołu: 15 sekund impulsu (20 mikronów), 30 sekund przerwy. Powtórz ten krok pięć razy.
2. Lizat z ogniwa wirówkowego w stężeniu 21 000 x g i 4 °C przez 15 minut oraz filtrujący supernatant za pomocą sterylnego systemu filtra strzykawkowego (o rozmiarze porów 0,2 μm).
   NUTA: Osadki komórkowe z udanych próbek sonikowanych mają przezroczyste brzegi.
3. Użyj zautomatyzowanego systemu oczyszczania wyposażonego w kolumnę powinowactwa opartą na^Ni-2+ o pojemności 5 mL do oczyszczania frakcji RTA oznaczonej Hisem z sterylnie filtrowanego supernatantu E. coli. Ogólnie używaj prędkości elucii 1 mL/min i chłodzi cały system oczyszczania, aby zapobiec nieefektywnemu wiązaniu toksyn i utracie aktywności toksyn.
   NUTA: Parametry efektywnego oczyszczania RTA są wymienione w Tabeli 1.
   1. Krótko mówiąc, wyrównaj kolumnę powinowactwa z 20 mL bufora wiązania, aby usunąć bufor magazynowy. Nałóż sterylnie filtrowany supernatant na kolumnę afinitetową za pomocą strzykawki.
   2. Przemyj kolumnę 25-35 ml buforu wiążącego, aby usunąć niezwiązane białka z kolumny. Wykonuj proces mycia aż absorpcja UV na 280 nm zbliży się do początkowej wartości UV.
   3. Frakcja RTA wiązana elutem w 20-35 mL buforu elucijnego (500 mM imidazol, 500 mM NaCl, 20 mM KH₂PO₄, pH = 7,2) i trzyma próbkę na lodzie (rysunek 1A i rysunek 1B).
      NUTA: Eluacja ułamku RTA charakteryzuje się wzrostem absorpcji promieni UV. Prosimy pamiętać, aby zbierać wyłącznie tę frakcję, aby zapobiec zanieczyszczeniu białkami niespecyficznymi wiązanymi.

Tabela 1: Parametry stosowane do oczyszczania i odsalania opartego na kolumnach. Lista wszystkich istotnych ustawień kolumny (np. przepływ, stężenie bufora elucijnego, równowaga i czas trwania kroku płukania) oraz zmierzone parametry (np. przewodność lub absorpcja UV).

Parametr chromatografii powinowactwa
Parametry pomiarowe	UV (280 nm), stężenie buforu elution, przewodność
Ustawienia	Zmienna/jednostka	Wartość
Przepływ	mL/min	1
Maksymalne ciśnienie kolumnowe	Mpa	0.35
Długość fali	Nm	280 nm
Bufor wiązania	Pozycja pompy	A
Bufor elucijny	Pozycja pompy	B
Bufor elucijny koncentracji początkowej	%	0
Kompensacja objętości systemu	Ml	10
Równowaga kolumnowa	Ml	20
Podawanie próbki przez superloop/strzykawkę	Ml	Objętość lizatu komórkowego
Etap mycia	Ml	20-35
Etap elucii	Ml	20-35
Bufor elucijny koncentracji podczas elucii	%	100
Rekalibracja kolumny z 20% EtOH	Ml	50
Parametr odsalania
Parametry pomiarowe	UV (280 nm), przewodność
Ustawienia	Zmienna/jednostka	Wartość
Przepływ	mL/min	4
Maksymalne ciśnienie kolumnowe	Mpa	0.35
Długość fali	Nm	280 nm
Bufor wiązania	Pozycja pompy	A
Bufor elucijny	Pozycja pompy	B
Bufor elucijny koncentracji początkowej	%	0
Kompensacja objętości systemu	Ml	10
Równowaga kolumnowa	Ml	20
Podawanie próbki przez superloop/strzykawkę	Ml	Objętość lizatu komórkowego
Wtrysk buforu odsolonego (0,8 M sorbitol)	Ml	100
Rekalibracja kolumny z 20% EtOH	Ml	50

Wyniki

Rysunek 1: Reprezentatywne wyniki chromatografii powinowactwa i odsalania komórek E. coli zawierających pET-RTA(_His)6 lub kontroli wektora pustego. (A) Typowy wykres oczyszczania próbki ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Spektrofotometr Ultrospec 2100 pro	Amersham
Soniprep 150	MSE		stary model, inne dostępne modele
Fluoroskan Ascent	Thermo Scientific	5210470	Stary model, już niedostępny
ÄKTAPurifier	Thermo Scientific	28406266	Produkt zostaje wycofany i zastąpiony
Kolumna HP HisTRAP	GE Healthcare	17-5248-02
Kolumna odsolonia HiTRAP	GE Healthcare	11-0003-29
Sterylny filtr Midisart	Sartorius	16534K	Rozmiar poru 0,2 μm
Zestaw do testowania białka BCA	Przebijać	23225
Zestaw do testowania 660 nm	Thermo Scientific	22660
96 płyt studni	Thermo Scientific	260860