$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie bakteryjnej nanocelulozy (BNC)
Nuta: Wszystkie etapy wykonywane są w warunkach aseptycznych, chyba że zaznaczono inaczej.
- Przygotuj podłoże hodowla.
- Przygotuj 500 ml płynnego medium hodowlanego, łącząc 25 g ekstraktu drożdżowego, 15 g peptonu, 125,0 g manitolu oraz 500 ml wysokiej czystości wody. Mieszankę w autoklawie należy stosować w 120 °C przez 20 minut i przechowywać w 4 °C.
- Przygotuj 100 ml podłoża półstałego, dodając 15 g agaru do 5,0 g ekstraktu drożdżowego, 3,0 g peptonu, 25,0 g manitolu oraz 100 ml wysokiej czystości wody. Zautoklawuj tę mieszankę w 120 °C przez 20 minut. Po autoklawie nałóż 5 ml mieszanki do plastikowej miszki Petriego o wymiarach 90 mm x 16 mm. Pozwól roztworowi żelować w temperaturze 4 °C i przechowywać w tej temperaturze do dalszego użycia.
- Rehydrat szczepu Glucoacetobacter xylinus (G. xylinus) przechowywany w liofilizowanych fiolkach poprzez dodanie 1 ml płynnego medium hodowlanego i pipetowanie w górę i w dół, zgodnie z zaleceniami producenta.
- Zaszczepić szalki Petriego zawierające podłoża półstałe niewielkimi kroplami zawiesiny bakteryjnej za pomocą pętli inokulacyjnej. Upewnij się, że inokulum pokrywa całą szalkę Petriego, przesuwając pętlę w kierunku zygzaka od krawędzi do środka naczynia.
- Inkubuj szalki Petriego w temperaturze 26 °C przez 72 godziny w inkubatorze bez CO2. Po zakończeniu okresu inkubacji widoczne są małe białe kolonie. Jeśli kolonie nie są od razu użyte, przechowuj naczynia Petriego w temperaturze 4 °C, zamykając pokrywkę Parafilm i stawiając naczynia do góry nogami. Kolonie można przechowywać w ten sposób do 6 miesięcy.
- Przelej 2 ml płynnego medium hodowlowego do każdego dołku płytki do hodowli tkankowej z 24 dołkami. Weź dwie kolonie igłą inokulującą z zaszczepionych szalek Petriego i umieść je w pierwszym dołku płytki do hodowli tkankowej. Powtórz ten sam zabieg dla pozostałych 23 otworów.
- Inkubuj płytkę do hodowli tkankowej w temperaturze 30 °C przez 7 dni. Daje to łącznie 24 pellicle BNC o średnicy 16 mm i grubości około 2-3 mm, jak pokazano na Rysunku 1. Nuta: Nie zakłócaj hodowli bakterii w żadnym momencie podczas inkubacji, na przykład potrząsając płytkami. W okresie inkubacji G. xylinus wytłacza cząsteczki cukru glukozypranozy, tworząc polimerową siatkę krystaliczną na granicy powietrze-ciecz, która przyjmuje kształt i rozmiar kolby w warunkach statycznej uprawy. Ta matryca polimerowa, znana jako bakteryjna nanoceluloza (BNC), jest widoczna pod koniec okresu inkubacji.
- Pobierz pellicle BNC z podłoża i sterylizuj je w 200 ml roztworu 1% NaOH przez godzinę w temperaturze 50 °C, aby usunąć wszelkie ślady G. xylinus. Opcjonalnie mieszaj ten roztwór w 300 obr./min, używając pręta magnetycznego i płytki do mieszania. Usuń roztwór NaOH i dodaj 200 ml świeżo przygotowanego roztworu 1% NaOH. Powtarzaj ten sam proces raz lub aż pellicle BNC w roztworze nabiorą przezroczystego wyglądu.
- Przepłucz pelikule BNC wodą trzy razy i przechowuj je w wodzie o wysokiej czystości w RT. Upewnij się, że pelikule BNC są całkowicie zanurzone w wodzie i nie mogą wyschnąć w żadnym momencie.
- Autoklaw pelikule BNC w temperaturze 121 °C przez 20 minut. Uwaga: Badanie podskórne in vivo u szczura, przeprowadzone przez Märtsona i współpracowników, nie wykazało oznak degradacji BNC po 60 tygodniach od implantacji. Rzeczywiście, BNC jest w naturze degradowalny przez enzymy mikrobiologiczne i grzybowe, które są nieobecne u ssaków. Z drugiej strony, biodegradowalność BNC może być wynikiem procesów mechanicznych, chemicznych i biologicznych, które osłabiają sieć mikrofibryliową in vivo.
