$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie chemikaliów i sprzętu
1. Przygotuj 500 ml roztworu 1% heksasametofosforanu sodu (SHMP) (NaPO3)n i sterylizuj przez autoklaw.
2. Sterylizuj filtry nitrocelulozowe (NC) (pory 0,22 μm, średnica 47 mm) poprzez autoklawowanie w zamkniętych szklanych szalkach Petriego.
3. Sterylizacja filtrów NC (por 0,22 μm, średnica 25 mm) poprzez autoklawowanie w zamkniętych szklanych szalkach Petriego.
4. Waż i notuj masę pustą w jałowych probówkach 50 ml (z nakręconą kapslą) (jedna probówka na próbkę).
5. Przygotuj bufor Tris-EDTA (TE-buffer) 1x: przygotuj roztwór 10 mM Tris (tris(hydroksymitylo)aminometanu) i 1 mM buforu EDTA. Ustawij pH do 8 i sterylizuj przez autoklaw.
6. Przygotuj roztwór lizozymu (20 mg/ml) przez rozpuszczenie 0,02 g lizozymu w 1 ml buforu TE. Idealnie byłoby, żeby za każdym razem była świeża. Przechowuj w temperaturze 4 °C nie dłużej niż tydzień.
7. Przygotować roztwór fizjologiczny poprzez rozpuszczenie 8 g/l chlorku sodu (NaCl) w wodzie destylowanej. Sterylizuj przez autoklaw.
2. Separacja biomasy od osadów
1. Dodaj 3 g próbki osadu do wcześniej zważonych jałowych probówek o pojemności 50 ml, używając metalowych łyżarek z ogniem etanolu. Wykonaj to w czystej, sterylizowanej szafce biologicznej UV, aby uniknąć skażenia.
2. Dodaj 15 ml 1% sterylnego (autoklawowego) roztworu SHMP do próbki za pomocą sterylnej burettki z podziałem na stopień. Roztwór SHMP można również filtrować, aby uniknąć zanieczyszczenia.
3. Homogenizacja osadu i roztworu SHMP za pomocą rozpraszacza/homogenizatora cieczy (np. homogenizator Ultra-Turrax). 70% sterylizacja lub autoklaw tarczy dyspersyjnej przed użyciem. Uruchom homogenizację przez 1 minutę przy 17 500 obr./min. Pozwól próbce odpocząć przez 2 minuty, a następnie powtórz ujednolicenie przez 1 minutę przy tej samej prędkości obrotowej wirnika.
4. Niech próbka stanie na 10 minut. Na tym etapie osiadają najcięższe cząstki (minerały). Komórki i wszelkie organiczne składniki próbki pozostaną jednak w roztworze. Następnie przelej roztwór supernatantu (zawierającego biomasę komórkową) do czystej rurki o pojemności 50 ml, uważając, aby nie zakłócić granulki osadu.
5. Do granulki osadowej ponownie dodaj 15 ml 1% sterylnego (autoklawowego) roztworu SHMP przy użyciu sterylnej buretty stopniowanej. Następnie powtórz kroki 2.3 i 2.4. To powtarzanie zapewnia oddzielenie maksymalnej liczby komórek i cząstek organicznych od mineralnego składnika osadu. Supernatant tego drugiego rozdzielenia można połączyć z supernatantem z pierwszego rozdzielenia.
Nuta: Następujące kroki wykonuje się na supernatancie (zawierającym biomasę komórkową). Składnik mineralny (osad osadowy) można wyrzucić.
6. Wiruj próbkę w 20 x g przez 1 minutę. Ten etap zwiększa siłę przeciążenia na tyle, by osadzać się małe cząstki mineralne, podczas gdy materiał biologicznej komórki pozostaje w roztworze. Po wirowaniu przelej roztwór supernatantu (zawierającego biomasę komórkową) do czystej probówki o pojemności 50 ml. Wyrzuć granulki mineralne.
7. Określ ostateczną objętość roztworu zawierającego biomasę, ważąc próbkę. Określenie wagi pozwala uniknąć konieczności przenoszenia próbki do cylindra z stopniem i zmniejsza ryzyko skażenia.
3. Zbieranie biomasy na membranie filtracyjnej
1. Przygotuj jednostkę filtracyjną (dla membran o średnicy 47 mm) oraz pompę próżniową. Sterylizuj jednostkę filtracyjną przez autoclaving lub (jeśli szkło Pyrex) przez spryskanie ją 70% etanolem i palnikiem Bunsena. Pozwól mu ostygnąć, zanim kontynuujesz procedurę.
2. Dodaj sterylną membranę NC do jednostki filtracyjnej za pomocą wypalonych kleszczy z ogniem etanolu.
3. Dodaj połowę próbki supernatantu (od etapu 2.6) do jednostki filtracji membranowej i zbieraj komórki na membranie za pomocą pompy próżniowej.
4. Gdy ciecz całkowicie przejdzie przez filtr, zatrzymaj pompę próżniową i ostrożnie usuń membranę za pomocą kleszczy sterylizowanych ogniem etanolem. Umieść błonę w sterylnej szalce Petriego.
1. Przeciąć membranę na pół za pomocą nożyczek spalanych etanolem. Każdą połowę błony należy dodać do osobnej probówki o pojemności 2 ml. Połowa błony będzie wykorzystywana do ekstrakcji DNA i analizy całej społeczności bakteryjnej. Druga połowa filtra jest przechowywana w temperaturze -80 °C i pełni funkcję zapasowej.
5. Zamontuj nową membranę NC na jednostce filtracyjnej i zbieraj biomasę z drugiej połowy objętości próbki (od etapu 2.6) za pomocą pompy próżniowej.
6. Gdy ciecz całkowicie przejdzie przez filtr, zatrzymaj pompę próżniową i ostrożnie usuń membranę za pomocą kleszczy spalanych etanolem. Umieść całą membranę w osobnej probówce o pojemności 2 ml. Ta próbka zostanie użyta do leczenia oddzielenia endospor od komórek wegetatywnych. Próbkę można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
4. Liza komórek wegetatywnych
1. Przeprowadzenie zabiegu w celu oddzielenia endospor od komórek wegetatywnych na biomasie wcześniej zebranej na błonie NC (krok 3.6).
1. Jeśli błona była zamrożona, pozostawić ją w stanie RT na 10 minut do rozmrozu. Następnie umieść membranę w sterylnej misce Petriego i potnij ją (około 4 razy) na mniejsze kawałki za pomocą nożyczek spalanych etanolem. Następnie umieść wszystkie elementy filtra membranowego w sterylnej probówce o pojemności 2 ml.
2. Dodaj 900 μl buforu 1x TE (Tris-EDTA) (patrz 1.5) do probówki zawierającej błonę próbki i dokładnie wymieszaj za pomocą wiru. Na tym etapie biomasa jest usuwana z membrany do roztworu buforu TE.
3. Umieść tubkę w inkubatorze w 65 °C na 10 minut i 80 obr./min. Następnie wyjmij tubkę z inkubatora i pozwól jej ostygnąć przez 15 minut.
4. Dodaj 100 μl świeżo przygotowanego lizozymu (patrz 1.5), aby uzyskać końcowe stężenie 2 mg/ml. Nie dodawaj lizozymu przed schłodzeniem próbki do 37 °C, ponieważ może to rozłożyć enzym.
5. Inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 60 minut i 80 obr./min, co jest optymalnymi warunkami, w których lizozym może lizować komórki wegetatywne.
6. Po zakończeniu lizy należy dodać do próbki 250 μl 3N wodorotlenku sodu (NaOH) oraz 250 μl roztworu 6% dodecylosiarczanu sodu (SDS). Dodając to, objętość próbki osiąga 1,5 ml, a końcowe stężenie wynosi 0,5 N NaOH oraz 1% SDS.
7. Inkubować tę mieszankę na RT przez 60 minut i 80 obr./min. Dodanie bazy i detergentów pomoże w końcowej lizie komórek. Stężenie tych detergentów zostało zoptymalizowane tak, aby nie uszkadzać endospor podczas lizowania komórek wegetatywnych.
8. Przygotuj sterylną jednostkę filtracyjną utrzymującą membrany o średnicy 25 mm poprzez autoklaw lub (jeśli szkło Pyrex) spryskiwanie jej 70% etanolem i palenie palnikiem Bunsena. Pozwól mu ostygnąć.
9. Na jednostce filtracyjnej zamontuj membranę NC o średnicy 0,2 μm (średnica 25 mm) za pomocą kleszczy sterylizowanych ogniem etanolowym.
10. Dodaj próbkę z etapu 4.7 na membranę i przefiltruj ciecz za pomocą pompy próżniowej. Gdy ciecz przejdzie przez ciecz, wyłącz pompę próżniową. Na tym etapie usuwa się lizowany materiał komórkowy wegetatywny, ponieważ nie jest on zatrzymywany na błonie. Na błonie pozostają tylko endospory.
11. Dodaj 2 ml sterylnego roztworu fizjologicznego, aby zmyć resztki detergentów i przefiltrować ciecz za pomocą pompy próżniowej.
12. Gdy ciecz zostanie całkowicie przefiltrowana, należy wyłączyć pompę próżniową. Zostaw membranę na jednostce filtracyjnej.