Generowanie czystych kultur bakteryjnych w płynnym medium

Streszczenie

Źródło: Brumfield, K. D. i in., Techniki laboratoryjne stosowane do utrzymania i rozróżniania biotypów Vibrio cholerae Clinical and Environmental isolates. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film pokazuje wzrost kultur bakteryjnych w płynnym pożywce. Wstrząsanie sprzyja napowietrzaniu i równomiernie rozdziela składniki odżywcze, wspierając wzrost wykładniczy i skutkując jednolitą, metabolicznie aktywną zawiesiną odpowiednią do zastosowań w dalszych etapach.

Protokół

1. Utrzymanie i wzrost szczepów Vibrio cholerae

1. Przygotowanie i stosowanie kultur mrożonego materiału
   1. Pellet 1,8 mL płynnej hodowli przez noc przez 2 minuty przez wirowanie (≥8 600 x g) w sterylnej rurce mikrowirówki o pojemności 2 mL, usuń supernatant i ponownie zawiesij pellet komórkowy w 900 μL świeżego bulionu Luria-Bertani (LB) przez pipetowanie.
   2. Dodaj do hodowli 900 μL sterylnego glicerolu 60% (v/v) i wymieszaj przez wirowanie.
   3. Przelej mieszankę do sterylnej probówki kriogenicznej o pojemności 2 mL i przechowuj ją w nieskończoność w temperaturze -80 °C.
   4. Aby użyć, usuń niewielką ilość zamrożonego bulionu za pomocą sterylnej pętli inokulacyjnej i nanieś smugię dla pojedynczych kolonii na płytkach agarowych LB. Po użyciu natychmiast przywróć mrożony bulion do -80 °C, aby zapobiec całkowitemu rozmrażeniu hodowli. Inkubuj płytki od pokrywy do dołu przez 12 do 16 godzin w temperaturze 37 °C.
2. Wzrost hodowli nocnych w ciekłym medium
   1. Pas dla pojedynczych kolonii (zgodnie z sekcją 1.1.4) z mrożonego bulionu na płytki agaru LB. Inkubuj płytki od pokrywy do dołu przez 12 do 16 godzin w temperaturze 37 °C.
   2. Zaszczep 4 mL płynnego bulionu LB w sterylnej probówce hodowli 10 mL z pojedynczą kolonią, dotykając powierzchni pojedynczej kolonii sterylnym patyczkiem aplikatora i przenosząc kolonię do płynnego bulionu.
   3. Inkubuj z napowietrzaniem w inkubatorze shakerowym z prędkością 225 obrotów na minutę (rpm) przez 12 do 16 godzin w temperaturze 37 °C.

Materiały